孫彥欣，左玉柱，李建輝，范京惠，裴麗華，楊 震，王晨楓

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北保定 071001）

豬細(xì)小病毒（Porcine parvovirus，PPV）主要引起初產(chǎn)母豬的繁殖障礙。PPV除單獨(dú)感染豬外，該病毒與豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus type 2，PCV2）的混合感染更為普遍，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。核衣殼蛋白VP2是PPV的主要保護(hù)性抗原，而且具有保守性[1-4]。

PCV2是目前發(fā)現(xiàn)最小的動(dòng)物病毒。Stevenson等研究表明，位于ORF1內(nèi)201位～220位氨基酸的多肽P21為免疫優(yōu)勢(shì)T細(xì)胞表位，免疫動(dòng)物后，動(dòng)物體內(nèi)的淋巴細(xì)胞明顯增多，而且免疫動(dòng)物血清中PCV2特異的抗體水平亦明顯升高[5]。Mahe等研究結(jié)果顯示，位于ORF1內(nèi)185位～211位氨基酸的多肽P4（與P21共享201位～211位氨基酸）內(nèi)存在一個(gè)B細(xì)胞表位[6]。以上結(jié)果提示，多肽P21內(nèi)存在PCV2特異的優(yōu)勢(shì)抗原表位，為研制抗原表位疫苗的優(yōu)勢(shì)目標(biāo)表位。本實(shí)驗(yàn)通過在PPV主要保護(hù)性抗原VP2基因上游插入PCV2多肽P21基因并構(gòu)建真核重組質(zhì)粒，免疫小鼠后觀察PPV VP2基因疫苗免疫效力，為研制高效、新型核酸疫苗提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 HEK293T細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)細(xì)胞典型培養(yǎng)物中心；6周齡～8周齡雌性BALB/c小鼠購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、pMD18-T載體、DL2000 DNA Marker等均購(gòu)自TaKaRa公司；預(yù)染蛋白Marker購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒為天根生化科技有限公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（HRP-IgG）購(gòu)自Promega公司；感受態(tài)E.coliDH5α、pcDNA3.1（+）載體由本實(shí)驗(yàn)室保存；PPV、PCV2株由本實(shí)驗(yàn)室從河北省部分地區(qū)患豬體內(nèi)分離獲得。

1.2 VP2基因引物的設(shè)計(jì)與片段擴(kuò)增 采用引物YVP2：5'-TCTGGATCCATGAGTGAAAATGTGGAA C-3'（BamHⅠ）和 ZVP2：5'-AGTCTCGAGTGATTAA CCAAGTAACTGA-3'（XhoⅠ）擴(kuò)增VP2基因，反應(yīng)條件為：95℃ 5 min；94℃ 1 min、52℃ 1 Min、72℃2 Min，30個(gè)循環(huán)；72℃10 Min，產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。采用小量凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化，并克隆于pMD18-T載體中，采用小量質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒DNA，進(jìn)行酶切鑒定，并命名為pMD-VP2。

1.2.1 P21基因引物的設(shè)計(jì)與片段擴(kuò)增采用引物P1：5'-GGTACCATGGATGGATATCATGGAGAAG AAGTTGTTGTTGTTTTGGAGGA-3'（KpnⅠ）和 P2：5'-GGATCCCCAAGGTAACCAGCCATAAAAATCAT CCAAAACAACAA-3'（BamHⅠ）擴(kuò)增 P21基因，反應(yīng)條件為：70℃ 5 Min；23℃或室溫退火 5 Min，37℃ 30 min、70℃ 10 Min；產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，小量凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收。

1.2.2 pcDNA-p21-vp2真核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建將PPV的VP2基因克隆至pcDNA3.1的BamHⅠ和XhoⅠ之間的多克隆位點(diǎn)，并在VP2基因的5'端插入PCV2的T細(xì)胞表位基因P21（GATGGATATC ATGGAGAAGAAGTTGTTGTTTTGGATGATTTTTAT GGCTGGTTACCTTGG）。構(gòu)建 pcDNA-p21-vp2真核表達(dá)重組質(zhì)粒，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.2.3 pcDNA-p21-vp2的細(xì)胞轉(zhuǎn)染與表達(dá)產(chǎn)物鑒定采用質(zhì)粒抽提試劑盒制備pcDNA-P21-VP2，磷酸鈣轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行裂解。將細(xì)胞裂解物SDS-PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上，分別以鼠抗PCV2抗體或鼠抗PPV抗體為一抗，以羊抗鼠HRP-IgG為二抗，DNB顯色，進(jìn)行western blot鑒定。

1.3 動(dòng)物試驗(yàn) 將6周齡～8周齡雌性BALB/c小鼠20只隨機(jī)分成4組，每組5只。實(shí)驗(yàn)組Ⅰ肌肉注射pcDNA-P21-VP2，10μg/只；實(shí)驗(yàn)組Ⅱ肌肉注射質(zhì)粒pcDNA-3.1（+），10μg/只；實(shí)驗(yàn)組Ⅲ肌肉注射PPV滅活疫苗100μL/只；實(shí)驗(yàn)組Ⅳ肌肉注射PBS溶液100μL/只作為對(duì)照組。免疫分3次進(jìn)行，每次免疫時(shí)間間隔為2周，免疫后0～6周每周尾靜脈采血分離血清，-20℃保存?zhèn)溆?。首免?2 d，無(wú)菌摘取小鼠脾臟，常規(guī)方法制備脾細(xì)胞懸液，用于淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)的測(cè)定。

1.4 免疫小鼠血清PPV和PCV2抗體水平的檢測(cè)參照文獻(xiàn)[7]的方法：用100 mM（pH9.6）碳酸鈉緩沖液2倍稀釋PPV病毒液以及PCV2病毒液（病毒滴度約為10-6/mL），取100μL病毒稀釋液在4℃下包被96孔板過夜，次日用1%BSA 37℃封閉1 h，被檢血清為倍比稀釋的免疫和非免疫小鼠血清（1∶4～1∶512），檢測(cè)抗體為羊抗鼠 HRP-IgG（1∶2 000），TMB為底物，檢測(cè)OD450nm值。

1.5 MTT法測(cè)定淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[8]的方法，采用RPM I 1640完全培養(yǎng)基懸浮免疫小鼠脾臟淋巴細(xì)胞（2×106細(xì)胞/mL）。在96孔板中每孔加入50μL細(xì)胞懸浮液，每份細(xì)胞懸浮液分3孔，將經(jīng)紫外線滅活的PCV2或PPV作為有絲分裂原為試驗(yàn)組，以ConA刺激組（10μg/mL）為陽(yáng)性對(duì)照組，RPM I-1640營(yíng)養(yǎng)液（無(wú)犢牛血清）為空白對(duì)照組，每組3個(gè)重復(fù)；混勻后，37℃5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)48 h。每孔加入20μL MTT（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)3 h。每管加入150μL二甲椏楓（DMSO）溶液，使紫黑色結(jié)晶完全溶解。在1 h內(nèi)用酶標(biāo)儀測(cè)定OD570nm值。

2 結(jié) 果

2.1 VP2、P21基因的PCR擴(kuò)增 將VP2、P21基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳觀察結(jié)果，分別在約1 700 bp、60 bp處出現(xiàn)特異性的DNA片段，與預(yù)期（1 740 bp、60 bp）相符（圖1）。經(jīng)測(cè)序表明，擴(kuò)增的VP2和P21基因序列與GenBank登錄的序列一致。

圖1 VP2與P21基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification of VP2 and P21 gene by PCR

2.2 重組質(zhì)粒pcDNA-P21-VP2的鑒定 重組質(zhì)粒pcDNA-P21-VP2分別用KpnⅠ和XholⅠ、BamHⅠ和XholⅠ、KpnⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，電泳結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒分別得到大小約為1 800 bp、1 740 bp和60 bp的目的片段，與預(yù)期結(jié)果相符，表明目的基因已經(jīng)正確插入表達(dá)載體的閱讀框中。

2.3 表達(dá)產(chǎn)物的western blot鑒定 采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將pcDNA-P21-VP2和pcDNA3.1（+）質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，48 h收集細(xì)胞，裂解處理后，經(jīng)western blot分析，pcDNA-P21-VP2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞在67 ku處出現(xiàn)特異性反應(yīng)帶，而同步轉(zhuǎn)染的pcDNA3.1（+）質(zhì)?？瞻讓?duì)照未出現(xiàn)特異性條帶，表明外源基因已在HEK293T細(xì)胞中獲得表達(dá)，并且表達(dá)的67 ku重組蛋白能夠識(shí)別鼠抗PPV、鼠抗PCV2的高免血清（圖2）。

圖2 Western blot檢測(cè)重組P21-VP2在HEK293FT細(xì)胞的表達(dá)Fig.2 Detection of recombinant P21-VP2 expressed in HEK293FT cells by western blot

2.4 免疫小鼠血清中PPV、PCV2 IgG抗體的檢測(cè)結(jié)果 分別采集免疫0～6周小鼠血清，通過ELISA方法檢測(cè)抗體水平。分別用PPV、PCV2包被96孔板，采用羊抗鼠IgG-HRP抗體分別檢測(cè)血清PPV、PCV2的IgG型抗體。結(jié)果表明pcDNA-P21-VP2能夠誘導(dǎo)小鼠機(jī)體產(chǎn)生抗PPV特異性抗體，并且高于pcDNA-3.1（+）組和 PBS組（p<0.05）（圖 3）。與 PPV滅活苗組進(jìn)行比較，pcDNA-P21-VP2重組質(zhì)粒組所誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗PPV的IgG抗體略高于PPV滅活苗（p>0.05）。pcDNA-P21-VP2可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生明顯的免疫反應(yīng)，并且可以長(zhǎng)時(shí)期維持較高水平。經(jīng)ELISA檢測(cè)血清中PCV2抗體，結(jié)果表明接種pcDNA-P21-VP2組，免疫后OD450nm值逐漸升高，而接種pcDNA3.1（+）組和空白對(duì)照組則保持平穩(wěn)（圖4）。接種pcDNA-P21-VP2組從14 d開始PCV2抗體水平明顯高于其余兩組（p<0.05），結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的pcDNA-P21-VP2能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗PCV2抗體。

2.5 淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果 分析pcDNA-P21-VP2核酸疫苗細(xì)胞免疫應(yīng)答水平，本實(shí)驗(yàn)采用MTT法初步分析了免疫小鼠淋巴細(xì)胞的增殖情況（圖5）。試驗(yàn)結(jié)果顯示，pcDNA-P21-VP2核酸疫苗免疫組的小鼠淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)均高于空載體及空白對(duì)照組（p<0.05）。表明pcDNA-P21-VP2核酸疫苗免疫小鼠，對(duì)體內(nèi)的淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)有明顯促進(jìn)作用。

圖3 免疫小鼠ppv抗體水平Fig.3 Dynam ics of PPV specific IgG antibodier in mouse serum

圖4 免疫小鼠pcv2抗體水平Fig.4 Dynam ics of PCV2 specific IgG antibodier in mouse serum

圖5 淋巴細(xì)胞增殖結(jié)果Fig.5 The results of lymphocyte proliferation assay

3 討 論

PPV的VP2基因表達(dá)蛋白不僅自身可以作為疫苗，在外源多肽的轉(zhuǎn)運(yùn)及多價(jià)疫苗的研制中也發(fā)揮重要作用[9-12]。Sedlik等以桿狀病毒表達(dá)載體PACYM對(duì)PPV VP2和包含淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦炎病毒（LCMV）的118位～132位氨基酸的抗原決定簇區(qū)進(jìn)行融合表達(dá)，該融合蛋白免疫鼠可以誘導(dǎo)強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)（CTL反應(yīng)），在體內(nèi)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)9個(gè)月，并可以抵抗致死量的LCMV攻擊[10]。Pan等在PPV VP2基因N端插入PCV2抗原表位，在腺病毒中表達(dá)嵌合病毒樣顆粒，具有良好的免疫原性[12-13]。本實(shí)驗(yàn)借鑒該思路，在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，將PCV2多肽P21插入VP2基因N端進(jìn)行融合表達(dá)，產(chǎn)物與PPV、PCV2高免血清可以發(fā)生抗原抗體反應(yīng)。

本研究構(gòu)建pcDNA-P21-VP2，將其轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，并將構(gòu)建的pcDNAP21-VP2免疫小鼠，通過ELISA方法檢測(cè)免疫后小鼠PPV、PCV2的IgG抗體變化，結(jié)果顯示小鼠免疫后2周就開始產(chǎn)生PPV及PCV2特異性抗體，表明所構(gòu)建的pcDNA-P21-VP2己轉(zhuǎn)染小鼠體內(nèi)細(xì)胞并在細(xì)胞中表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物作為抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。第二次加強(qiáng)免疫后，試驗(yàn)組小鼠的抗體水平上升幅度很大，表明本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的pcDNA-P21-VP2能夠誘導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)中的B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生免疫記憶，這一結(jié)果也預(yù)示了PPV基因核酸疫苗具有良好的前景，為PPV及PCV2的防制提供了新的思路和技術(shù)儲(chǔ)備，同時(shí)也為其它傳染病的核酸疫苗研究提供依據(jù)。

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