張 念，馬玉媛，向思龍，賈俊婷，吳健敏，章金剛

（1.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林長春 130062；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所國家生物醫(yī)學(xué)分析中心/病毒安全檢測實驗室，北京 100850；3.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所，廣西南寧 530001）

豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒（Porcine endogenous retrovirus，PERV）是與豬→人異種移植病原安全性密切相關(guān)的一類病毒。體外研究已證明PERV能夠感染人源細(xì)胞[1]，這一發(fā)現(xiàn)引起了人們對異種移植病原安全性的廣泛關(guān)注。

PERV屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科哺乳動物C型反轉(zhuǎn)錄病毒屬，為單股正鏈RNA病毒，基因組全長為8.1 kb～8.9 kb，由5'非編碼區(qū)、種群特異性抗原（gag）基因、聚合酶（pol）基因、囊膜（env）基因及3'非編碼區(qū)組成，gag、pol基因相對env基因具有較高保守性，env基因主要決定其感染范圍及細(xì)胞嗜性[2]。

五指山小型豬具有體型小、遺傳穩(wěn)定、耐粗飼等國外小型豬不可比擬的優(yōu)點[3]，其基因組中PERV的基因序列拷貝數(shù)較低[4]，有望為異種移植提供合適供體。本實驗室在前期研究初步表明：五指山來源的PERV-env序列中存在著較多的G→A突變。因此，本實驗在前期研究基礎(chǔ)上以連續(xù)3代次近交系五指山小型豬為研究對象，對其來源的PERV env基因變異特征（G→A突變）進行深入研究。此研究有助于PERV分子特性的研究，也一定程度上為豬→人異種移植中的病毒安全性評價提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 連續(xù)3個代次（F18、F19、F20）近交系五指山小型豬耳組織（每代次3個樣品，共9個樣品），來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所。

1.2 主要試劑 rTaqDNA聚合酶、dNTP（10mM）、dATP（100mM）、DL2000/5000Marker、SalⅠ、XbaⅠ等購自TaKaRa公司；phusion高保真DNA聚合酶購自NEB公司；膠回收試劑盒、高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒、TOP10感受態(tài)細(xì)胞購自Tiangen公司；基因組DNA純化試劑盒購自Promega公司。

1.3 樣品處理 將豬耳組織剪碎后放進經(jīng)液氮預(yù)冷的研缽中，研磨成粉末狀。使用基因組DNA純化試劑盒提取樣品基因組DNA，并測其濃度及純度。

1.4 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中本實驗室登錄的五指山來源的PERV-A序列（EF133960），設(shè)計一對引物用于PERV-env基因擴增，產(chǎn)物為1981bp。PERV-envF： 5'-GATCCATGCATCCCACGTTA-3'，PERV-envR：5'-CCGGTCAGTTTCTCCTTAGC-3'，由中美泰和生物技術(shù)（北京）有限公司合成。

1.5 PERV-env基因的擴增、克隆及測序 以五指山小型豬耳基因組DNA為模板，進行PERV-env基因擴增及克隆。從每個樣品中隨機選取3個陽性克隆進行測序。

1.6 生物信息學(xué)分析 以本實驗室在GenBank登錄的五指山小型豬PERV（EF133960）序列env基因為參考序列，用DNAMAN軟件進行序列比對。根據(jù) GenBank登 錄 的 PERV（PERV-A：AJ293656、AJ279056； PERV-B： AY099324、 AY056035；PERV-C： AF038599、 AF038600； PERV-A/C：AY570980、AY953542）env基因序列，用Clustalx W（DNAStar軟件包）進行多重序列比對，使用MEGA4軟件對PERV-env基因進行遺傳進化分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 PERV-env基因擴增 利用常規(guī)PCR方法擴增得到PERV-env基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示與預(yù)期大?。? 981 bp）相符（圖1）。

2.2 五指山小型豬PERV-env基因序列分析 實驗共獲得27條PERV-env核苷酸序列，其同源性為97.1%～99.5%，與參考序列同源性為98.3%～99.3%。序列比對結(jié)果表明：每代次小型豬PERV-env序列中均存在堿基突變，G→A突變數(shù)目明顯多于其他堿基突變數(shù)目（表1），最多可達40個，突變率最高可達60.43%（表2），并且發(fā)生位置偏好于GA、GG即負(fù)鏈TC、CC，此突變偏好位點與Harris RS[5]和Patric J等[6]研究結(jié)果（G→A突變偏好發(fā)生于負(fù)鏈TC、CC）一致。

豬APOBEC3F（pA3F）是豬體內(nèi)唯一的一種APOBEC家族蛋白分子，該家族分子主要作用于病毒復(fù)制過程中的負(fù)鏈cDNA鏈，導(dǎo)致C→U的突變，造成病毒無法正常復(fù)制或?qū)е虏《救毕菟劳?，從而起到抗病毒作用[7]。結(jié)合本室前期對pA3F的研究[8]以及國外相關(guān)報道[9-10]，推測PERV-env序列中G→A突變可能是pA3F作用的結(jié)果。

對連續(xù)3代次五指山小型豬PERV-env序列G→A突變數(shù)目進行單因素方差分析表明：3代次小型豬之間PERV-env序列G→A的突變數(shù)目并無明顯差異（p>0.05）。分析其原因可能為pA3F對PERV的作用具有長期累積效應(yīng)，此效應(yīng)還待進一步研究。此外，序列分析表明，與參考序列相比，五指山小型豬來源的PERV-env序列190 bp及1 875 bp位置均存在G→A突變，此結(jié)果有助于PERV分子變異機制的進一步研究。

表1 近交系連續(xù)3代五指山小型豬PERV-env序列中堿基突變數(shù)目（中位數(shù)）Table 1 The number of basemutationin in PERV-env sequences from WZSPs（median）

表2 近交系連續(xù)3代五指山小型豬PERV-env序列中G→A的突變數(shù)目Table 2 The number of G→A mutation in PERV-env sequences from WZSPs

對五指山豬來源的與其他小型豬來源的PERV-env序列進行多重序列比對，結(jié)果顯示五指山豬來源的PERV-env序列與PERV-A、B、C、A/C亞型env序列同源性分別為96.7%～98.9%、76.4%～77.7%、84.9%～85.7%、84.9%～95.8%。遺傳進化樹顯示PERV-A、B、C 3種亞型明顯地分為3支，本實驗中五指山豬來源的PERV與國外小型豬來源的PERV-A亞型親緣關(guān)系最為接近，但仍存在一定差異（圖1）。

本實驗對五指山小型豬來源的PERV-env基因進行G→A突變研究，有助于深入研究pA3F對五指山豬來源的PERV復(fù)制的影響及作用機制，為進一步開展異種移植中PERV的安全性評價奠定基礎(chǔ)，對于我國特有小型豬的開發(fā)利用具有重要意義。

圖1 連續(xù)3代次五指山小型豬PERV-env基因系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic tree based on PERV-env gene of three consecutive generations of WZSPs

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