竇文文，李宏梅，成子強(qiáng)，劉建柱，劉海港，井維芳，崔治中，郭慧君

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院山東省生物工程與疫病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271018）

J亞群禽白血病病毒（Subgroup J avian leukosis virus，ALV-J）是上個(gè)世紀(jì)90年代從肉雞中鑒定的一種新亞型白血病病毒，它引起骨髓細(xì)胞瘤病。中國(guó)首次在1999年從白羽肉雞中分離到ALV-J[1]，近年來(lái)，ALV-J已傳播到中國(guó)不同地區(qū)的某地方品系雞[2-4]及蛋用型雞[5-6]中。ALV-J的感染已在中國(guó)雞群中廣泛流行，給中國(guó)養(yǎng)雞業(yè)造成嚴(yán)重的損失。

為控制ALV-J在中國(guó)地方種雞中的流行，需要對(duì)我國(guó)地方種雞實(shí)施凈化。由于我國(guó)種雞品系和種群數(shù)量大、飼養(yǎng)不規(guī)范和飼養(yǎng)密集等特點(diǎn)，可能需要較長(zhǎng)時(shí)間的凈化才能達(dá)到感染率非常低的防控要求；此外，還需要借助其他的防制方法降低雞群的ALV-J感染率，以達(dá)到加快凈化的目的[5]。使用疫苗預(yù)防是一有效的可選擇方法，但對(duì)ALV-J至今尚未有有效的疫苗在生產(chǎn)中加以應(yīng)用。

本研究通過(guò)原核表達(dá)ALV-J的gp85囊膜蛋白并采用不同免疫佐劑和免疫程序?qū)﹄r雞進(jìn)行免疫接種，對(duì)其免疫保護(hù)作用進(jìn)行研究，為開(kāi)發(fā)有效的ALV-J亞單位疫苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病毒、細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ALV-JNX0101株和單克隆抗體（MAb）JE9及DF-1細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；海蘭褐1日齡雛雞購(gòu)自泰安市東岳種禽場(chǎng)，試驗(yàn)前進(jìn)行ALV感染檢測(cè)，全部為陰性者進(jìn)行動(dòng)物免疫接種試驗(yàn)。

1.2 質(zhì)粒與菌株 pMD18-T simple vector試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；pET-32a（+）載體購(gòu)自Invitrogen公司；大腸桿菌（E.coli）DH5α和BL21（DE3）菌株均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 主要試劑 常用核酸和蛋白等分子試劑購(gòu)自TaKaRa公司；膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；免疫佐劑包括F佐劑和C佐劑，前者購(gòu)自北京博奧生物有限公司，后者被設(shè)計(jì)后由寶生物工程（大連）有限公司合成；ALV-J抗原P27 ELISA檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：99-09254）和抗體ELISA檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：99-09268）均購(gòu)自美國(guó)IDEXX公司。

1.4 A LV-J gp85蛋白免疫抗原的制備 根據(jù)GenBank登錄的NX0101株env序列（AY897227）設(shè)計(jì)引物：5'-CGCGGATCCGGAGTTCATCTGTTGCAAC AACCA-3'（BamHⅠ）和 5'-CCCAAGCTTGGCGCCTG CTACGGCGGTG-3'（HindⅢ），以 NX0101 DNA為模板，按照TaKaRa公司的高保真TaqDNA聚合酶說(shuō)明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析。

PCR產(chǎn)物克隆于pMD18-T載體中，經(jīng)雙酶切、膠回收后亞克隆于pET-32a（+）表達(dá)載體中，由北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，并命名為pET32a（+）-gp85。將其轉(zhuǎn)化E.coliBL21（DE3），用1 mmol/L IPTG 37℃誘導(dǎo)表達(dá)，按照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南介紹方法純化His-Jgp85蛋白。以J亞群囊膜糖蛋白特異性MAb JE9通過(guò)western blot方法檢測(cè)重組蛋白的抗原特異性。

1.5 動(dòng)物免疫保護(hù)試驗(yàn)

1.5.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)7日齡海蘭褐公雞60只隨機(jī)分為：gp85組，gp85+F組，gp85+F+C組，每組至少10只雞，并設(shè)空白質(zhì)粒表達(dá)蛋白免疫組6只雞（pET32a組）。每只雞分別腿部肌肉注射0.2 ML（100μg）重組蛋白。gp85組接種免疫蛋白稀釋液，gp85+F組接種免疫蛋白與F佐劑的乳化液，gp85+F+C組接種免疫蛋白、F和C佐劑的混合乳化液，對(duì)照組接種滅菌PBS緩沖液，pET32a組每只雞注射同等劑量的表達(dá)的空質(zhì)粒蛋白。一免后第3周每組部分雞進(jìn)行二次加強(qiáng)免疫，免疫方法和劑量同前；二免后第5周進(jìn)行ALV-JNX0101毒株攻毒保護(hù)試驗(yàn)，除對(duì)照組6只雞外其余雞只腹腔注射攻毒，劑量為102.2TCID50/只雞，攻毒后連續(xù)兩周進(jìn)行病毒血癥檢測(cè)和致病性觀察。在首次接種后第1周～第11周每周采集血清，-20℃儲(chǔ)存用于抗體水平檢測(cè)。

1.5.2 血清ALV-J抗體檢測(cè)用IDEXX公司的ALV-J抗體ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)抗體水平，具體方法見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書。酶標(biāo)儀檢測(cè)樣品OD450nm值，比較各組的抗體水平。

1.5.3 病毒血癥檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)[6]中相關(guān)步驟進(jìn)行。取接種細(xì)胞上清經(jīng)凍融后使用ALV P27抗原ELISA檢測(cè)試劑盒按使用說(shuō)明檢測(cè)，并判斷病毒血癥的陰性和陽(yáng)性。

1.5.4 攻毒后致病性檢測(cè)記錄攻毒后3周內(nèi)各試驗(yàn)組雞只體重變化和剖檢后脾臟、法氏囊等組織重量變化，計(jì)算增重和器官發(fā)育指數(shù)；脾臟一部分液氮保存，一部分用于制作組織切片和ALV-JMAb JE9介導(dǎo)的免疫熒光（IFA）檢測(cè)。

器官發(fā)育指數(shù)=器官重/體重×100%

1.6 數(shù)據(jù)處理 所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（X±SD）表示，組間差異性用ANOVA軟件分析，p<0.05表示差異顯著，p<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 利用設(shè)計(jì)的引物，對(duì)ALV-Jgp85基因進(jìn)行擴(kuò)增，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a-NX0101-Jgp85，對(duì)該重組質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，得到一條約為900 bp的特異性片段（圖1A）。該重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后，經(jīng)凝膠電泳分析表明在5.9 kb的載體pET-32a（+）處有一清晰條帶，與預(yù)期大小一致；經(jīng)測(cè)序后分析表明得到目的基因大小為909 bp，與預(yù)期結(jié)果相符。證明gp85目的基因已插入表達(dá)載體中。

2.2 gp85的誘導(dǎo)表達(dá)、純化與免疫原性分析 將重組質(zhì)粒pET32a-NX0101-Jgp85轉(zhuǎn)化至受體菌BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)行SDS-PAGE分析，目的蛋白得到高效表達(dá)，均為包涵體形式，表達(dá)蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量約為53 ku；使用Ni-NTA純化表達(dá)蛋白，經(jīng)純化后得到純度較高的his-gp85重組蛋白（圖1B）；該蛋白經(jīng)western blot分析表明在53 ku相應(yīng)的位置出現(xiàn)一條清晰的免疫反應(yīng)帶，表明E.coli表達(dá)的gp85重組蛋白與ALV-J亞群MAb JE9[7]發(fā)生特異性結(jié)合（圖1C）。

圖1 pET32a-NX0101-Jgp85重組質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增（A）及其重組蛋白的純化（B）和western blot分析（C）Fig.1 PCR amplification（A）,purification（B）and specificity analysis（C）of recombinant protein

2.3 不同免疫佐劑和免疫次數(shù)對(duì)gp85重組蛋白誘導(dǎo)生成抗體的作用 使用ALV-J抗體試劑盒檢測(cè)接種后雞只生成抗體變化的結(jié)果（圖2）。

圖2 不同免疫佐劑和免疫次數(shù)對(duì)gp85重組蛋白誘導(dǎo)抗體的影響Fig.2 Effect of different adjutants and inoculated numbers on the antibodies induced by the recombinant protein of gp85

圖中顯示gp85+F組和gp85+F+C組在一免和二免后ALV-J陽(yáng)性血清抗體顯著高于gp85重組蛋白免疫組，gp85免疫組在一次免疫后陽(yáng)性血清僅維持大約7 d時(shí)間；二次加強(qiáng)免疫后陽(yáng)性血清抗體維持約28 d，并且最高效價(jià)較低。gp85+F組免疫后，一免后抗體從第7 d開(kāi)始上升，第14 d達(dá)到最高，隨后下降，至第56 d；二免后能夠維持并繼續(xù)促進(jìn)抗體生成至第42 d達(dá)到最高，隨后下降至第77 d試驗(yàn)觀察結(jié)束仍有較高的抗體。gp85+F+C組抗體具有相似的變化規(guī)律，所不同的是抗體下降速度慢，抗體效價(jià)總體高于gp85+F組。另外，二次免疫也進(jìn)一步促進(jìn)抗體的生成，并維持時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)。

2.4 不同免疫佐劑和免疫次數(shù)對(duì)gp85重組蛋白誘導(dǎo)抗體陽(yáng)性雞只比例的變化 經(jīng)一免后的雞只，gp85組抗體陽(yáng)性率較低，最高僅有50%；gp85+F組從第14 d開(kāi)始全部產(chǎn)生抗體，直到第49 d，隨后降低；gp85+F+C組從第21 d全部雞只產(chǎn)生抗體，到攻毒時(shí)第56 d有80%的雞只有陽(yáng)性血清抗體。經(jīng)二免后，gp85免疫組，抗體陽(yáng)性率有所升高，在28 d～42 d期間達(dá)到80%以上；gp85+F組可以在免疫后第14 d至第63 d全部產(chǎn)生抗體，而gp85+F+C組可以在第28 d至第77 d全部產(chǎn)生抗體。試驗(yàn)結(jié)果顯示二次免疫和所用兩種免疫佐劑可以增強(qiáng)雞只對(duì)重組蛋白免疫的免疫原性。

2.5 不同免疫的雞只攻毒后病毒血癥的變化 使用CEF和DF1細(xì)胞對(duì)攻毒后雞只的血漿進(jìn)行病毒分離，檢測(cè)病毒陽(yáng)性比例；并統(tǒng)計(jì)不同雞只抗體存在情況（表1）。未免疫攻毒組病毒血癥陽(yáng)性率為87.5%，gp85免疫組為66.7%；gp85+F組為46.2%，gp85+F+C組為33.3%；以上3個(gè)免疫接種組免疫保護(hù)率分別為33.3%、53.8%和66.7%。其中所免疫保護(hù)雞只中抗體陽(yáng)性比例為16/19（84.2%），抗體陰性比例為3/19（15.8%）；未被保護(hù)的雞只中抗體陰性比例為 12/18（66.7%）。

表1 攻毒后第2周不同病毒血癥和抗體雞只的比例（率）Table 1 The ratios of chickensw ith different viremia and antibody at the second week after challenge by ALV-J

2.6 不同免疫的雞只攻毒后健康狀況檢測(cè) 表2顯示各試驗(yàn)組在攻毒后3周時(shí)間內(nèi)體重變化、脾臟和法氏囊發(fā)育變化，由于組間個(gè)體差異較大，體重變化和增重變化沒(méi)有顯著差異，但使用gp85+F+C組雞增重比未免疫未攻毒組增長(zhǎng)69%，比未免疫攻毒組增長(zhǎng)107%；其它免疫組均比未免疫攻毒組有所升高，但比未免疫未攻毒組降低。未免疫攻毒處理的雞只脾臟和法氏囊凈重和發(fā)育指數(shù)比未攻毒組雞只有所下降，gp85免疫組脾臟凈重和發(fā)育指數(shù)進(jìn)一步降低，使用免疫佐劑聯(lián)合免疫的雞只升高；gp85+F+C組法氏囊凈重和發(fā)育指數(shù)比攻毒組升高，但仍低于未攻毒對(duì)照組。

表2 攻毒后3周體重和主要免疫器官發(fā)育指數(shù)的變化Table 2 Changes of body weight and main immune organs during 3 weeks after challenge by ALV-J

在攻毒后3周內(nèi)，未免疫未攻毒組雞只沒(méi)有死亡，剖檢未見(jiàn)明顯腫瘤變化；未免疫攻毒組死亡一只，其余均出現(xiàn)消瘦、冠蒼白、采食量下降等癥狀；gp85組在攻毒后死亡4只；gp85+F+C組死亡4只；gp85+F+C組死亡2只。經(jīng)ALV-JMAb介導(dǎo)的IFA檢測(cè)以上死亡雞只和未免疫攻毒雞只的脾臟組織顯示有大量特異性熒光出現(xiàn)；而免疫處理組未死亡的雞只精神狀態(tài)較好，未見(jiàn)發(fā)育異常，脾臟組織切片經(jīng)IFA檢測(cè)未見(jiàn)特異性熒光。

3 討 論

本研究利用ALV-J囊膜蛋白gp85基因經(jīng)原核表達(dá)制備其重組蛋白，利用該表達(dá)蛋白作為免疫原，對(duì)雛雞免疫能夠產(chǎn)生一定的抗體，但維持時(shí)間短、抗體效價(jià)低。這與先前報(bào)道中所遇到的問(wèn)題是相同的[8]，而利用F佐劑與gp85表達(dá)蛋白制備成免疫乳化劑后免疫提高了ALV-J抗體滴度和維持時(shí)間；同時(shí)使用二次加強(qiáng)免疫可以進(jìn)一步促進(jìn)ALV-J抗體的產(chǎn)生，高效價(jià)抗體可維持到第9周。

C佐劑是一種核酸佐劑，可以激活Toll樣受體，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生非特異性免疫反應(yīng)[9]。近年來(lái)一些文獻(xiàn)有關(guān)該佐劑促進(jìn)亞單位疫苗和DNA疫苗誘導(dǎo)雞體產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)的報(bào)道較多[10-11]；但在ALV-J方面的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用該佐劑與F佐劑制備成乳化佐劑，與gp85聯(lián)合免疫能夠進(jìn)一步促進(jìn)gp85基因表達(dá)產(chǎn)物免疫雞產(chǎn)生高效價(jià)抗體，維持時(shí)間在F佐劑基礎(chǔ)上又進(jìn)一步延長(zhǎng)，抗體下降速度減緩；二次加強(qiáng)免疫后，高效價(jià)抗體可以維持到11周。本研究再次證明了該佐劑具有促進(jìn)原核表達(dá)蛋白免疫原性的作用，是一種極具潛力的免疫佐劑。

使用病毒株ALV-JNX0101攻毒，觀察免疫接種后免疫保護(hù)作用?？梢钥闯鲆欢▌┝康腁LVJNX0101對(duì)60日齡的雞只也產(chǎn)生一定的免疫抑制和免疫器官發(fā)育障礙、甚至死亡等致病性。接種后的雞只產(chǎn)生不同保護(hù)力，特別是利用佐劑免疫的雞只，病毒血癥雞只減少，免疫器官發(fā)育得到改善；所被保護(hù)的雞只gp85抗體陽(yáng)性率達(dá)84.2%，而病毒血癥為陽(yáng)性的個(gè)體中抗體為陰性卻占66.7%，表明所產(chǎn)生的免疫保護(hù)作用與針對(duì)gp85抗體有直接的關(guān)系。值得注意的是本研究表明病毒血癥為陽(yáng)性的個(gè)體，其血清中也具有較高gp85蛋白的抗體，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因上值得進(jìn)一步研究。

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