趙雅瑞 張立凡 劉特

(1.上海醫(yī)藥職工大學(xué)，上海 200050;2.復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院胸外科，上海 200040;3.上海中醫(yī)老年醫(yī)學(xué)研究所，上海 200031)

在過去的20年中，肺癌的發(fā)病率和病死率不斷上升，且患者有年輕化的趨勢。目前越來越多的研究［1-2］證實，在許多腫瘤組織中，存在一群特殊的具有很強的增殖和侵襲能力細胞亞群，對多種化療藥物具有耐受性;該細胞亞群還表達胚胎干細胞的部分生物學(xué)標志物。基于上述特征，該腫瘤細胞亞群被稱為腫瘤干細胞或腫瘤起始細胞(carcinoma-initiating cells，CICs)。肺癌細胞中也存在CICs，該類細胞高表達CD44+和CD133+蛋白，且具有很強的化療藥物耐受性。因此，尋找能夠有效抑制CICs增殖的藥物顯得十分重要。姜黃素是從姜黃屬(Curcuma longa L.)植物根莖中提取的一種多酚類物質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于食品色素添加劑，具有顯著的抗氧化、抗突變作用。近期研究［3］證實，姜黃素可以抑制多種腫瘤細胞(如肝癌細胞、淋巴瘤細胞、前列腺癌細胞、結(jié)腸癌細胞等)的增殖和侵襲。本研究以肺癌CICs作為研究對象，探討姜黃素通過調(diào)控腫瘤增殖相關(guān)基因caspase-3和p53的表達來實現(xiàn)對該類細胞體外增殖和侵襲的抑制作用。

1 資料與方法

1.1 細胞及主要試劑 人肺癌細胞株A549和姜黃素由復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院實驗室保存。四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、核糖核酸酶 A(ribonuclease A，RNase A)購自美國 Sigma公司。DMEM細胞培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自美國Gibco公司。兔抗人CD44-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)抗體、兔抗人CD133-藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)抗體、兔抗人p53抗體、兔抗人caspase-3抗體及兔抗人GAPDH抗體購自美國CST公司。

1.2 肺癌CICs篩選與培養(yǎng) 依據(jù)參考文獻［4］的方法。A549細胞用 DMEM培養(yǎng)基［內(nèi)含10%FBS、青-鏈雙抗(青霉素 100 U/mL、鏈霉素 100 U/mL)］置于37℃，體積分數(shù)5%CO2孵箱中培養(yǎng)。選取處于對數(shù)生長期的A549細胞，用0.25%胰蛋白酶-EDTA處理后，離心收集細胞沉淀，然后分別加入2 μL兔抗人 CD44-FITC抗體和2 μL兔抗人CD133-PE抗體，4℃下孵育30 min，用PBS清洗1次，并重懸細胞。取500 μL細胞懸液(細胞濃度調(diào)整為2×107/mL)，用流式細胞儀進行細胞分選，并收集表達CD44+/CD133+的肺癌CICs。按實驗要求，將細胞分為3組:空白對照組(不作任何處理的細胞組);姜黃素處理組(IC50濃度姜黃素處理的細胞組);陰性對照組(加入DMSO處理的細胞組)。

1.3 MTT比色法檢測肺癌CICs增殖抑制 將空白對照組、陰性對照組和姜黃素處理組細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中(密度為2×103/孔)，置于37℃、含5%CO2孵箱中培養(yǎng)，當(dāng)細胞生長至指數(shù)期時，分別加入不同濃度的姜黃素(0、5、10、20、40、60、80、100 μmol/mL)進行干預(yù)，并于24 h后檢測。在檢測前4 h加入MTT 20 μL(5 mg/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。離心去上清液，加入DMSO溶解沉淀。用酶標儀在490 nm波長處讀取所對應(yīng)的吸光度(OD490值)，設(shè)立3個復(fù)孔，取其平均值。測得各孔吸光度數(shù)值，計算公式:(1－實驗組OD490值/對照組OD490值)×100%，計算出姜黃素對肺癌CICs的IC50濃度。

1.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)檢測增殖相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的影響 按照Trizol Reagent說明書的方法，抽提各組細胞的總RNA，并經(jīng)實時熒光定量PCR生成cDNA。以各組cDNA作為模板，在實時熒光定量PCR儀上利用兩步法進行實時熒光定量PCR，根據(jù)mRNA的相對變化量公式［Ratio=2-ΔΔCt，其中 ΔΔCt=(ΔCtSample Group-ΔCtBlank Control)］計算目標片段的擴增比例。擴增產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳進行觀察。各樣本重復(fù)實驗3次，以18S rRNA作為內(nèi)參照。目標片段的擴增引物序列為:caspase-3-FP:5'-CTGCCTCTTCCCCCATTCT-3';caspase-3-RP:5'-TCGCTTCCATGTATGATCTTTG-3';p53-FP:5'-GCTTTCCACGACGGTGAC-3';p53-RP:5'-GCTCGACGCTAGGATCTGAC-3';18S rRNA-FP:5'-CGTTGATTAAGTCCCTGCCCTT-3';18S rRNA-RP:5'-TCAAGTTCGACCGTCTTCTCAG-3'。兩步法中退火溫度為58℃，擴增循環(huán)數(shù)為40次。

1.5 Western blot檢測增殖相關(guān)蛋白表達量 于轉(zhuǎn)染24 h后收集各組細胞(根據(jù)Western blot試劑盒說明書中的步驟)，抽提各組細胞的總蛋白，利用Lowry法測定總蛋白濃度，以每個泳道20 μg濃度的蛋白樣品上樣，經(jīng)30%變性十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳后，利用半干電轉(zhuǎn)化法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，經(jīng)過封閉、一抗(稀釋倍數(shù)1∶1000)孵育、PBST洗脫、HRP標記的二抗(稀釋倍數(shù)1∶500)孵育、PBST再洗脫等步驟后，增強化學(xué)發(fā)光法(enhanced chemiluminecence，ECL)化學(xué)發(fā)光及X線片曝光，并且經(jīng)定影、顯影處理，獲得清晰條帶。利用BandScan軟件分析各條帶的灰度值。

1.6 Transwell小室侵襲實驗檢測姜黃素對肺癌CICs體外侵襲能力的影響

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差()表示，采用方差分析(ANOVA)或獨立樣本t檢驗進行比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 姜黃素有效抑制肺癌CICs體外增殖 MTT比色法檢測結(jié)果顯示，在低質(zhì)量濃度姜黃素(5、10和20 μmol/mL)作用下，姜黃素處理組細胞增殖抑制率與陰性對照組及空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，n=6)。而當(dāng)姜黃素質(zhì)量濃度增加至40 μmol/mL時，姜黃素處理組的細胞增殖抑制率顯著大于陰性對照組和空白對照組(P＜0.01，n=6)，而陰性對照組的細胞增殖抑制率與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，n=6)。本實驗結(jié)果表明，姜黃素對于肺癌CICs具有抑制增殖效果，且當(dāng)質(zhì)量濃度增加時，細胞的增殖抑制率也顯著增加。姜黃素對于肺癌CICs的增殖抑制作用呈劑量正相關(guān)，見圖1。按照公式計算，姜黃素處理肺癌CICs 24 h 的姜黃素 IC50 為61.06 μmol/mL。

圖1 MTT比色法檢測肺癌CICs增殖抑制率

2.2 姜黃素對肺癌CICs增殖相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的影響實時熒光定量PCR檢測腫瘤CICs增殖相關(guān)基因caspase-3和p53的mRNA表達結(jié)果顯示，姜黃素處理組細胞中caspase-3和p53基因mRNA的表達水平(3.64 ±0.59，4.98 ±0.82)高于陰性對照組(1.00 ±0.04，0.99 ±0.07)和空白對照組(0.99 ±0.07，1.03 ±0.27)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P 均 ＜0.01)，見圖2。結(jié)果表明，姜黃素能有效地活化腫瘤增殖抑制因子p53和凋亡因子caspase-3基因轉(zhuǎn)錄，由此抑制肺癌CICs在體外增殖。

圖2 實時熒光定量PCR檢測caspase-3和p53基因的表達

2.3 姜黃素對肺癌CICs增殖相關(guān)蛋白表達的影響Western blot檢測腫瘤凋亡相關(guān)蛋白caspase-3和p53的表達結(jié)果顯示，姜黃素處理組細胞中caspase-3和 p53蛋白表達水平(0.65 ±0.12，0.43 ±0.05)高于陰性對照組(0.05 ±0.02，0.08 ±0.03)和空白對照組(0.09 ±0.03，0.12 ±0.17)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01 和0.05，n=3)，見圖3。姜黃素可以有效地上調(diào)腫瘤增殖抑制因子p53蛋白和凋亡因子caspase-3蛋白的表達，由此抑制肺癌CICs在體外的增殖。

圖3 CICs中的caspase-3和p53蛋白表達

2.4 姜黃素抑制肺癌CICs的侵襲 采用Transwell小室侵襲實驗檢測各組肺癌CICs細胞在體外的影響，結(jié)果顯示，姜黃素處理組侵襲細胞數(shù)(26±15)少于陰性對照組(82±13)和空白對照組(78±12)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。而陰性對照組與空白對照組細胞侵襲數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見圖4。姜黃素可以有效地削弱肺癌CICs在體外基質(zhì)中的遷移與侵襲能力。

圖4 Transwell小室實驗檢測的肺癌CICs在體外的侵襲影響

3 討 論

目前關(guān)于姜黃素對CICs的作用機制的研究較少。姜黃素對CICs是否存在顯著的增殖抑制作用尚不明確。本研究通過分離肺癌CICs，利用相關(guān)分子生物學(xué)和細胞學(xué)技術(shù)，分析姜黃素對體外肺癌CICs增殖和侵襲的影響。本研究結(jié)果表明，隨著姜黃素質(zhì)量濃度的提高，肺癌CICs的增殖抑制率也顯著提高。同時，姜黃素可以顯著提高肺癌CICs內(nèi)caspase-3和p53基因mRNA和蛋白的轉(zhuǎn)錄和表達。caspase-3是死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑中關(guān)鍵的啟動因子。caspase-3能夠通過寡聚而自身切割活化，并能激活下游半胱氨酸蛋白酶，產(chǎn)生凋亡效應(yīng)。caspase-3在誘發(fā)細胞凋亡及細胞增殖抑制等方面發(fā)揮著重要的作用。而p53蛋白是廣譜的腫瘤抑制因子，是細胞生長周期中的負調(diào)節(jié)因子，與細胞周期的調(diào)控、DNA修復(fù)、細胞凋亡與腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等重要的生物學(xué)功能有關(guān)［5-7］。本研究證實，姜黃素激活p53和caspase蛋白的表達后可抑制肺癌CICs體外增殖。Transwell小室侵襲實驗還揭示了姜黃素可以有效抑制肺癌CICs的侵襲能力。

［1］ Lundin A，Driscoll B.Lung cancer stem cells:Progress and prospects［J］.Cancer Lett，2012，17(3):239-245.

［2］ Nurwidya F，Murakami A，Takahashi F，et al.Lung cancer stem cells:Tumor biology and clinical implications［J］.Asia Pac J Clin Oncol，2012，8(3):217-222.

［3］ Metzler M，Pfeiffer E，Schulz SI，et al.Curcumin uptake and metabolism［J］.Biofactors，2013，39(1):14-20.

［4］ Gao Y，Liu T，Cheng W，et al.Isolation and characterization of proliferative，migratory and multidrug-resistant endometrial carcinoma-initiating cells from human typeⅡendometrial carcinoma cell lines［J］.Oncol Rep，2012，28(2):527-532.

［5］ Shadfan M，Lopez-Pajares V，Yuan ZM.MDM2 and MDMX:Alone and together in regulation of p53［J］.Transl Cancer Res，2012，1(2):88-89.

［6］ Inoue K，Kurabayashi A，Shuin T，et al.Overexpression of p53 protein in human tumors［J］.Med Mol Morphol，2012，45(3):115-123.

［7］ Prabhu VV，Allen JE，Hong B，et al.Therapeutic targeting of the p53 pathway in cancer stem cells［J］.Expert Opin Ther Targets，2012，16(12):1161-1174.