蘇雷，李文思，肖黎，秦盛斐，佟明

(遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院泌尿外科，遼寧錦州 121001)

前列腺癌已成為影響我國男性尤其是50歲以上男性健康的一個重要因素，向激素非依賴的轉化是前列腺癌進展中最為惡性的事件，它使得疾病幾乎不可治愈［1］。治療雄性激素非依賴性前列腺癌在目前來說仍然是一個臨床難題，這使得改變治療方式非常急迫。自從2005年在高度惡性的膠質(zhì)母細胞瘤中發(fā)現(xiàn)miRNA-21是一種凋亡抑制因子以來，對于它的關注度就一直未減［2］。更引人注目的是，1年以后miRNA-21在6種實體腫瘤中均被發(fā)現(xiàn)是一種唯一的上調(diào)因子，這6種腫瘤中包括前列腺癌［3］。本實驗通過觀察激素非依賴前列腺癌細胞系PC3在轉染miRNA-21抑制劑后miRNA-21的表達情況，探討miRNA-21對PC3增殖及侵襲性影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

人前列腺癌細胞株PC3細胞(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞中心);RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco公司);活性炭葡聚糖處理的胎牛血清(Biowest公司);Lipo2000轉染試劑(Invitrogen公司);miRNA-21抑制劑(廣州銳博公司);TR-PCR試劑盒(Takara公司);CCK-8反應液(江蘇碧云天公司);Transwell細胞培養(yǎng)(Chemicon公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及轉染 人前列腺癌細胞株PC3置RPMI 1640完全培養(yǎng)基中(不含抗生素)，37℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔日換液1次，細胞平鋪培養(yǎng)瓶底超過85%時進行傳代。轉染前1 d鋪96孔板，次日將miRNA-21抑制劑按轉染試劑盒操作說明進行轉染。

1.2.2 RT-PCR檢測miRNA-21的表達 將轉染后的人前列腺癌細胞株PC-3(轉染組)接種于96孔板完全培養(yǎng)基中，并且鋪滿約90%。設置未加miRNA-21抑制劑轉染組為空白對照組，孵育48 h后，Trizol法提取細胞總RNA后用miRNA提取試劑盒提取miRNA，反轉錄合成cDNA，配置PCR反應液擴增后，取10～20 μl點樣在濃度為 2% 的瓊脂糖凝膠上(含 0.5 μg·ml－1溴化乙錠)，0.5 μl TAE 作為電泳緩沖液，以160 V電壓進行電泳，30 min停止電泳。紫外透射儀觀察電泳結果并攝取圖像，應用GSG2002核酸/蛋白質(zhì)凝膠圖像分析管理系統(tǒng)進行灰度值測定，以每一樣品與其內(nèi)參β-actin的比值代表該樣品miRNA-21的相對含量。

1.2.3 CCK-8檢測轉染后細胞增殖 將轉染后的人前列腺癌細胞株PC-3接種于96孔板完全培養(yǎng)基中，并且鋪滿約90%，轉染組與空白對照組分別孵育24、48、72 h。已接種好細胞的孔板每孔中加10 μl CCK-8檢測液和100 μl完全培養(yǎng)液，孵育2 h后放入酶標儀中檢測，以450 nm吸光度值進行讀數(shù)并記錄數(shù)值。

1.2.4 Transwell小室結合CCK-8檢測細胞侵襲力取24孔0.8 μm的Tanswell細胞培養(yǎng)板(上室內(nèi)已鋪好基質(zhì)膠)，按Chemicon公司的說明要求，在上室加入300 μl預溫的無血清培養(yǎng)基，室溫下靜置20 min，使基質(zhì)膠水化，再吸除培養(yǎng)基，將轉染組與空白對照組的PC3細胞經(jīng)胰酶消化后，以 2×103ml－1接種于Transwell細胞培養(yǎng)板上室，待細胞貼壁后，更換上室內(nèi)培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基。下室用胎牛血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)36 h，除去上室內(nèi)細胞，用CCK-8法間接檢測小室培養(yǎng)板下室的細胞吸光度即代表穿過基質(zhì)膠及聚碳酸酯膜細胞的數(shù)量，對比穿過細胞數(shù)量即代表侵襲力變化。

1.3 統(tǒng)計學處理

所有資料均采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。在符合正態(tài)性和方差齊性的前提下，以±s進行統(tǒng)計學描述;統(tǒng)計推斷則采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 miRNA-21的相對含量

RT PCR檢測顯示，miRNA-21相對表達量空白對照組為0.50 ±0.02，轉染組為 0.34 ±0.01，兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，表示經(jīng)過轉染能成功抑制miRNA-21在PC3中的表達(圖1)。

圖1 對照組與轉染組miRNA-21的相對表達量PC3.The control group;PC3-IN.Transfection groupFig 1 Relative expression of micrornas-21 in control group and transfection group

2.2 CCK-8檢測細胞增殖

見表1。

72 h增殖分析結果顯示，轉染組與空白對照組細胞增殖情況差異有統(tǒng)計學意義(24 h:t=2.792，P＜0.05;48 h:t=16.067，P ＜0.01;72 h:t=19.902，P ＜0.01)，表明抑制miRNA-21的表達后PC3細胞的增殖能力明顯降低。

表1 CCK-8檢測PC3細胞吸光值(A)(x±s)Tab 1 CCK 8 testing PC3 cells absorb light values(A)(x±s)

2.3 Transwell小室結合CCK-8法檢測細胞侵襲力

CCK-8法檢測吸光度結果表明，轉染組吸光度值為0.28 ±0.04，空白對照組吸光度值為 0.63 ±0.06，兩組差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，表明抑制miRNA-21的表達后PC3細胞的侵襲力降低。

3 討 論

miRNA是真核生物中一種約22～24個核苷酸大小、參與轉錄后基因調(diào)控的非編碼單鏈小分子RNA。它可特異性的識別靶mRNA的3'-非翻譯區(qū)(3'-UTR)并與之結合，引起靶mRNA的降解或翻譯抑制，進而對基因進行轉錄后的表達調(diào)控，調(diào)節(jié)許多重要的細胞生物學行為［4］。在過去的短短幾年中，在大樣本癌癥人群中對miRNA已經(jīng)進行了廣泛的研究，普遍采用的方法是基因雜交，或基于PCR的技術手段，包括寡核苷酸微矩陣研究，基于免疫磁珠的流式細胞儀檢測以及qRT-PCR等。在眾多的癌癥中，miRNA-21表現(xiàn)出過度的表達(如前列腺癌、肝癌、白血病、卵巢癌等)。盡管對于miRNA-21是不是原癌基因或者miRNA-21在癌癥中是否起到關鍵性的作用還存在較大的爭議，但是miRNA-21已經(jīng)是眾多miRNA中最受關注和研究的最為深入的miRNA之一。Lu等［5］在對各種實體腫瘤和其對應的正常組織的miRNA大規(guī)模的篩查中發(fā)現(xiàn)，miRNA-21在PC-3中的表達水平較其他腫瘤細胞，如 HEL、TF-1、293、MCF-7 和 SKMEL-5 等顯著增高。這項研究提示，我們miRNA的資料具有高度的信息價值，并且關系到腫瘤發(fā)生中的不同譜系和不同階段。另外，這一結果與 Chan 等［6］和 O'donnrl等［7］發(fā)表的文獻結果相同。高水平miRNA-21的單一表達能有效地對付去勢的拮抗作用。更重要的是，RT-PCR分析顯示，miRNA-21在PCa中的表達遠遠高于其鄰近正常組織。這些結果都說明miRNA-21能促進PCa的病理發(fā)生過程并且可作為癌癥侵襲的標志［8］。

本實驗通過轉染miRNA-21抑制劑，直接抑制了人前列腺癌細胞株PC3中miRNA-21的表達。在成功抑制miRNA-21的表達后通過CCK-8法測得轉染組細胞增殖能力減弱，證明了miRNA-21的低表達可降低細胞增殖能力。但細胞的增殖能力并不能反映其侵襲能力，而Transwell小室的構建(使得腫瘤細胞要向下室內(nèi)遷移，則必須突破的基質(zhì)膠方能進入下室)能較好地反映其侵襲性，且采用CCK-8法間接測量比傳統(tǒng)光鏡下多視野直接計數(shù)法更為準確。實驗中轉染組的侵襲性較空白對照組的侵襲性明顯減弱(P＜0.01)，說明抑制miRNA-21的表達后，PC3細胞侵襲能力減弱。因此，抑制miRNA-21在非激素依賴性前列腺癌細胞PC3中的高表達能減弱其增殖及侵襲能力，為進一步進行體內(nèi)腫瘤細胞侵襲能力的研究奠定了基礎，并可能通過調(diào)節(jié)miRNA-21的表達來抑制腫瘤的增殖及侵襲能力。

我們考慮miRNA-21在體內(nèi)可能通過誘導G1期的細胞進入細胞周期，促使雄性激素依賴的細胞生長。通過反義鎖定寡核苷酸或者是拮抗劑減少非雄性激素依賴的PC3的集落形成和腫瘤的發(fā)生。miRNA-21在前列腺癌細胞的過度表達，降低了雙氫睪酮的含量，引起PSA的上調(diào)，增強了非雄性激素依賴性的增長。提示miRNA-21有可能控制了關鍵因子在非依賴性前列腺癌細胞PC3的表達，這些關鍵因子和維持雄性激素耐受性疾病的發(fā)生有關。這個發(fā)現(xiàn)為我們進一步研究雄性激素非依賴性前列腺癌提供了理論價值。

［1］GANDELLINI P，F(xiàn)OLINI M，ZAFFARONI N，et al.Towards the definition of prostate cancer-related microRNAs:where are we now［J］.Trends Mol Med，2009，15(9):381-390.

［2］CHAN J A，KRICHEVSKY A M，KOSIK K S.MicroRNA-21 is an antiapoptotic factor in human glioblastoma cells［J］.Cancer Res，2011，65(14):6029-6033.

［3］VOLINIA S，CALIN G A，LIU C G，et al.A microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets［J］.ProcNatl Acad Sci USA，2010，103(7):2257-2261.

［4］CHEN C Z，LI L，LODISH H F，et al.MicroRNAs modulate hematopoietic lineage differenti-ation［J］.Science，2010，303(5654):83-86.

［5］LU J，GETZ G，MISKA EA，et al.MicroRNA expression profiles classify human cancers［J］.Nature，2005，435:834-838.

［6］CHAN J A，KRICHEVSKY A M，KOSIK K S.MicroRNA-21 is an antiapoptotic factor in human glioblastoma cells［J］.Cancer Res，2008，65:6029-6033.

［7］O'DONNELL K A，WENTZEL E A，ZELLER K I，et al.c-Myc-regulated microRNAs modulate E2F1 expression［J］.Nature，2007，435:839-843.

［8］RIBAS J，NI X，HAFFNER M，et al.miRNA-21:an androgen receptor regulated microRNA that promotes hormone-dependent and hormone-independent prostate cancer growth［J］.Cancer Res，2009，69(18):7165-7169.