王東凱，黃國(guó)慶，吳 瓊，陳麗娟

(1.黑龍江省對(duì)俄工業(yè)技術(shù)合作中心，哈爾濱150090;2.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，哈爾濱150020)

熒光假單孢菌(Pseudomonas fluorescens)是菌根促生細(xì)菌的主要類(lèi)群，具有拮抗多種植物病原真菌的能力。在不同土壤和不同植物類(lèi)型菌根際微生物群落有很大差異。Cristiana等研究證明被灰白松露(Tuber borchii)侵染的歐洲櫟(Quercus robur)菌根上多為熒光假單孢菌和皺紋假單孢菌(P.corrugata)，此類(lèi)細(xì)菌具有促進(jìn)菌根真菌孢子萌發(fā)和菌絲體生長(zhǎng)的能力［1-3］。本項(xiàng)目是對(duì)從俄羅斯引進(jìn)的菌根促生細(xì)菌與生物防治菌－熒光假單孢菌分離鑒定，發(fā)酵條件，菌劑制備和生物防治應(yīng)用研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種:由俄羅斯科學(xué)院分子遺傳研究所引進(jìn)熒光假單孢菌菌劑。由黑龍江省科學(xué)院高研院微生物分子生物學(xué)試驗(yàn)室分離、純化獲得，為熒光假單孢菌ELS—1菌株，用KB培養(yǎng)液活化、培養(yǎng)。供試病原菌為油菜菌核病菌由國(guó)家南方農(nóng)藥創(chuàng)制中心提供，用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.1.2 滑石粉(藥用滑石粉)等所用化學(xué)試劑均購(gòu)于哈爾濱化學(xué)試劑公司?；圯d體材料經(jīng)兩次高壓滅菌，每次121℃，處理30 min，烘干備用。

1.1.3 立式全溫恒溫振蕩器IS－RDVI，哈爾濱東聯(lián)電子儀器廠生產(chǎn)。30立升不銹鋼發(fā)酵罐，BLBIO—30SJ型，上海百侖生物科技有限公司生產(chǎn)。高速冷凍離心機(jī)H2050R，湖南心湘儀生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 熒光假單孢菌菌株的分離純化鑒定方法，參照文獻(xiàn)進(jìn)行［4-5］。分離出純化的單菌落，在試管斜面培養(yǎng)，置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 發(fā)酵條件的選擇，參照文獻(xiàn)并略加修改進(jìn)行［6-7］。

1.2.3 熒光假單孢菌菌懸液的制備方法，參照文獻(xiàn)并略加修改進(jìn)行［8-9］。發(fā)酵完成后，離心收集熒光假單孢菌ELS—1菌體，再用新鮮的KB液體培養(yǎng)基懸浮，使菌懸液中活菌數(shù)達(dá)到l×108個(gè)/mL。作為生防菌劑備用。

1.2.4 菌劑制備方法。參照文獻(xiàn)進(jìn)行［8］?；酆汪燃谆w維素鈉經(jīng)121℃高壓滅菌3次。每次滅菌30min，干燥后備用。前項(xiàng)所得到的菌懸浮，活菌數(shù)達(dá)到l×108個(gè)/mL以上。再加入少許2%的羧甲基纖維素鈉溶液，充分混勻后，按比例與滑石粉混合(100︰24，m︰v)，室溫放置48h后，裝袋密封，室溫貯藏。使用時(shí)，用平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)菌劑中活菌數(shù)，檢測(cè)時(shí)重復(fù)3次。

1.2.5 菌劑中有效熒光假單孢菌ELS—1菌株菌體釋放率的測(cè)定，參照文獻(xiàn)進(jìn)行［8］。

1.2.6 熒光假單孢菌ELS—1生防菌劑對(duì)油菜菌核病的防效試驗(yàn)方法，參照文獻(xiàn)并略加修改進(jìn)行［9－10］。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光假單孢菌的純化鑒定和菌落特征

按照文獻(xiàn)方法，在KB培養(yǎng)基上純化鑒定出熒光假單孢菌，在紫外燈下檢出產(chǎn)熒光的菌落，該菌在KB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，如圖1，菌落微隆起，淡黃色，邊緣光滑，表面較濕潤(rùn)，可產(chǎn)生水溶性黃綠色色素，紫外光照射下有黃綠色熒光產(chǎn)生，如圖2所示，革蘭氏陰性，桿狀，具極生鞭毛。

圖1 KB培養(yǎng)基上的熒光假單孢菌菌株ELS—1菌落Fig.1 Colonies of Pseudomonas fluorescens on KB medium

2.2 熒光假單孢菌生理生化特性

圖2 紫外光下熒光假單孢菌菌株ELS—1的熒光菌落Fig.2 Fluorescence colonies of ELS—1 under UV

篩選出的產(chǎn)熒光的細(xì)菌菌株ELS—1參照文獻(xiàn)并略加修改進(jìn)行［8］。進(jìn)行生理生化鑒定，結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)熒光假單孢菌相同。特性是最適生長(zhǎng)溫度為28℃～30℃，低于4℃、高于41℃均不生長(zhǎng);產(chǎn)生熒光色素、不產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素和膿青素;可以利用檸檬酸鹽，對(duì)青霉素有抗性;氧化酶、接觸酶和精氨酸雙水解酶陽(yáng)性，脂酶(Tween80)反應(yīng)陰性;明膠液化、吲哚反應(yīng)陽(yáng)性，水解淀粉、反硝化、V—P反應(yīng)陰性。定為熒光假單孢菌中的已知種。

2.3 篩選確定發(fā)酵條件及擴(kuò)大培養(yǎng)和發(fā)酵生產(chǎn)熒光假單孢菌菌體

在搖瓶發(fā)酵所建立的發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上，對(duì)工業(yè)培養(yǎng)基進(jìn)行30 L發(fā)酵罐的放大試驗(yàn)。由于發(fā)酵罐的攪拌和通氧條件均優(yōu)于搖瓶發(fā)酵，因此菌體濃度和茵體形態(tài)都明顯好于搖瓶發(fā)酵。由圖3和鏡檢可知，接種O～4 h，菌數(shù)很少，pH值變化很小;4～24 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體數(shù)量迅速增加，pH急劇下降;24～36 h對(duì)數(shù)生長(zhǎng)結(jié)束，菌體進(jìn)入穩(wěn)定期，新陳代謝減慢，pH開(kāi)始回升，桿狀菌體大量脫落形成球狀類(lèi)芽孢菌體，28 h達(dá)到最大菌數(shù)178億/mL，32 h 95%的菌體形成整齊的球狀菌體，所以28～32 h為最佳放罐時(shí)間。然后進(jìn)入衰亡期，菌數(shù)減少，pH值繼續(xù)回升，48 h時(shí)pH值到達(dá)7.8。通過(guò)以上試驗(yàn)，確定了熒光假單孢菌(P.Fluorescen)BES—1菌體最佳發(fā)酵條件:溫度為28℃，pH 為7.0，裝液量為20 mL/250 mL三角瓶，200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)。通過(guò)對(duì)幾種工業(yè)碳源和氮源的比較并在3個(gè)水平上進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定最佳培養(yǎng)基組成:可溶性淀粉10 g/L，豆餅粉15 g/L，葡萄糖 3 g/L，KH2P04 0.6 g/L，CaCO32 g/L。30 L發(fā)酵罐(裝量20 L)擴(kuò)大培養(yǎng)，可使最大發(fā)酵菌數(shù)達(dá)到1.78×1010/mL。試驗(yàn)中所確定的發(fā)酵培養(yǎng)基配方，其原料來(lái)源廣泛，價(jià)格低廉，很適合農(nóng)業(yè)上應(yīng)用，為熒光假單孢菌的工業(yè)化生產(chǎn)提供了良好的條件。

2.4 載體滑石粉的用量對(duì)熒光假單孢菌ELS—1菌株吸附的效果

從圖4可以看出，隨著滑石粉用量的增加，Q也呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，L呈下降趨勢(shì)。當(dāng)滑石粉用量從1 g/L增加到12/L時(shí)，Q值從2.19%增長(zhǎng)到37.59%，此后增長(zhǎng)緩慢;滑石粉用量從1 g/L增加到8 g/L，L值變化較大;從600 mg/g驟減到41.80 mg/g，隨著滑石粉用量的繼續(xù)增加，L值下降緩慢。當(dāng)滑石粉用量為20g/L時(shí)，Q值為40.51%，L值為27.75 mg/g。

圖3 發(fā)酵罐菌體生長(zhǎng)的曲線(xiàn)Fig.3Growth curve of Pseudomonas fluorescens

圖4 滑石粉的用量對(duì)吸附效果的影響Fig.4 Influence of talc powder dosage on the adsorption effect

結(jié)果表明，滑石粉對(duì)熒光假單孢菌ELS—1菌體的去除能力強(qiáng)，而負(fù)載能力略有減少。當(dāng)載體用量為1 g/L時(shí)，負(fù)載能力有所增加。從整個(gè)吸附過(guò)程來(lái)看，滑石粉對(duì)熒光假單孢菌ELS—1菌株具有較好的吸附能力，用量的多少影響其對(duì)菌體的吸附效果。載體用量增多，可供菌體吸附的面積也相應(yīng)增大，當(dāng)菌體質(zhì)量濃度一定時(shí)，單位質(zhì)量的載體負(fù)載量下降。

2.5 菌劑中熒光假單孢菌ELS—1菌的活菌數(shù)

從表1可以看出熒光假單孢菌ELS—1菌體在兩種菌劑中的存活數(shù)量隨時(shí)間延長(zhǎng)有明顯差異。保存2d以滑石粉為載體的菌劑中菌體數(shù)目均保持在1011數(shù)量級(jí)。

表1 菌劑中熒光假單孢菌ELS—1的活菌數(shù)量Tab.1 The number of living Pseudomonas fluorescens ELS—1 in the dried powder agent

2.6 ELS—1活體菌劑對(duì)油菜菌核病的溫室防治效果

溫室試驗(yàn)結(jié)果，如表2所示，噴施熒光假單孢菌ELS—1菌劑50倍液和菌懸液均能有效控制油菜菌核病的發(fā)生(P＜0.05)，與不施用ELS—1菌劑和菌懸液而接種油菜菌核病病菌的對(duì)照相比，發(fā)病率分別下降了33.17%和16.17%。病指防效分別為87.85%和52.14%。二者存在極顯著差異(P＜0.001)，這可能與載體包埋有關(guān)。載體包埋菌體后，對(duì)其具有一定的保護(hù)作用，有利維持活菌數(shù)，保證了菌體的抑菌活性。與空白對(duì)照相比，ELS—1菌劑和菌懸液對(duì)幼苗的根部有顯著地促生作用(P＜0.05)，處理組的油菜根重較不施用任何菌劑的對(duì)照分別增長(zhǎng)了65.72%和45.29%。但對(duì)葉片數(shù)的增加影響不大。溫室試驗(yàn)結(jié)果也顯示，采用菌餅接種法將油菜菌核病病菌接種到油菜葉柄基部的效果顯著，油菜菌核病發(fā)病癥狀明顯減少，且不污染土壤和周?chē)参?，方法便利，可用于田間試驗(yàn)。

表2 熒光假單孢菌ELS—1菌劑對(duì)油菜菌核病的溫室防治效果及幼苗生長(zhǎng)的影響Tab.2 Influence of Sclerotinia sclerotiorum ELS—1 on greenhouse control effect and seedling growth

3 討論

(1)熒光假單孢菌是一種常見(jiàn)的菌根促生細(xì)菌，其與菌根真菌有著密切的關(guān)系。1962年，Mosse就分離到AMF孢子促生菌(Pseudomonas sp)，并發(fā)現(xiàn)其有助于AMF侵染宿主。用電子顯微鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)AMF(Gigaspora margarita)的孢子和菌絲上粘附著熒光假單孢菌及根瘤菌。

本試驗(yàn)分離得到熒光假單孢菌(P.ftuorescens)ELS—1說(shuō)明植物菌根上存在一定數(shù)量的菌根促生熒光假單孢菌。本研究還發(fā)現(xiàn)當(dāng) P.Fluorescens ELS—1菌液濃度為0.8×109～2.4×109cfu/mL時(shí)，可在一定程度上促進(jìn)外生菌根真菌的生長(zhǎng)，當(dāng)P.fluorescens ELS—1菌液濃度大于2.4×109cfu/mL時(shí)，隨著菌液濃度的增大，對(duì)外生菌根真菌的抑制越明顯，這可能是菌根真菌與PGPR之間存在著對(duì)營(yíng)養(yǎng)及生態(tài)位的競(jìng)爭(zhēng)［10］，并可能產(chǎn)生10多種具有生防功能的次生代謝產(chǎn)物。

(2)發(fā)酵罐生產(chǎn)菌劑所使用的培養(yǎng)基的選擇對(duì)于熒光假單孢菌菌劑推廣應(yīng)用極為重要，本研究確定最主要成分為可溶性淀粉10 g/L、依次是豆餅粉15 g/L、葡萄糖3 g/L、KH2P04 0.6 g/L。

(3)滑石粉作為吸附劑的研究和應(yīng)用一直受到廣泛關(guān)注，目前還未見(jiàn)有關(guān)滑石粉吸附菌體的報(bào)道，國(guó)外有學(xué)者將滑石粉用作微生物農(nóng)藥的主要添加劑［11］。本試驗(yàn)滑石粉吸附包埋菌劑中熒光假單孢菌ELS—1菌體，降低了外界不良因素對(duì)活菌體的損害，同時(shí)菌體吸附于載體上，具有一定的緩釋效果，在貯藏期內(nèi)菌體釋放率較高，菌劑中活菌數(shù)保持在1010數(shù)量級(jí)，滑石粉均屬于非金屬礦產(chǎn)，資源豐富，開(kāi)采成本低。本試驗(yàn)的吸附試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)滑石粉對(duì)生防菌菌劑中熒光假單孢菌ELS—1菌株有較好的吸附效果，片層狀的滑石粉為菌劑中熒光假單孢菌ELS—菌株提供了豐富的吸附位點(diǎn)。同時(shí)，這種材料的吸附作用屬于物理吸附，因此吸附是一個(gè)快速的過(guò)程，在生產(chǎn)加工過(guò)程中能縮短用時(shí)，提高效率。當(dāng)振蕩溶解菌劑時(shí)，菌體也較容易從載體上釋放出來(lái)。如果在農(nóng)業(yè)防治上推廣應(yīng)用，不僅有助于滑石粉市場(chǎng)的進(jìn)一步開(kāi)拓，也對(duì)環(huán)境保護(hù)和生態(tài)維護(hù)起到不可估量的作用。本試驗(yàn)對(duì)菌劑載體材料的性質(zhì)和菌劑的防效進(jìn)行了初步研究，關(guān)于菌劑配方的優(yōu)化、貨架期的延長(zhǎng)、田間防效的測(cè)定以及菌劑施用方式還有待深入研究。

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