鄭淑婷，臧彧偉，楊龍，李偉

（長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025）

轉(zhuǎn)鐵蛋白（Transferrin，Tf）是一種鐵離子結(jié)合蛋白，典型的Tf 為70～80 kD 的β-球蛋白，包括位于分子N 端和C 端2 個(gè)氨基酸序列相似的結(jié)構(gòu)域，每個(gè)結(jié)構(gòu)域都能結(jié)合一個(gè)鐵離子[1,2]。Tf 最初在人、魚(yú)類、兩棲類和爬行類血清中被發(fā)現(xiàn)[3,4]，是運(yùn)輸和代謝鐵離子的重要因子，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和免疫系統(tǒng)的作用，參與抗菌殺菌和細(xì)胞保護(hù)過(guò)程[5,6]。Tf的抗菌殺菌機(jī)理可能與Tf 的螯合鐵特性、遺傳多態(tài)性和糖基（碳水化合物）三個(gè)方面有關(guān)[2,7]。20 世紀(jì)80年代至今，人們已完成虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、尼羅羅非魚(yú)（Oreochromis niloticus）等多種魚(yú)類Tf基因的克隆，證實(shí)了魚(yú)類Tf 氨基酸序列的保守性以及運(yùn)輸鐵離子功能的穩(wěn)定性[8,9]。

假單胞桿菌（Pseudomonas spp.）是遺傳多樣性豐富的革蘭氏陰性桿菌[10]。本研究中所用假單胞桿菌為本實(shí)驗(yàn)室從馴養(yǎng)的黃鱔（Monopterus albus）腸道分離出的一種非致病微生物。臧彧偉等[11]克隆了黃鱔腸道假單胞桿菌Bfr 基因，并實(shí)現(xiàn)了融合表達(dá)，發(fā)現(xiàn)添加外源Bfr 蛋白促進(jìn)了假單胞桿菌的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)。魚(yú)類Tf 對(duì)嗜水氣單胞菌等病原菌的生長(zhǎng)有抑制作用[12]，但尚無(wú)魚(yú)類Tf 對(duì)假單胞桿菌等非致病菌生長(zhǎng)影響的相關(guān)報(bào)道。

黃鱔是一種常見(jiàn)的淡水養(yǎng)殖魚(yú)類，廣泛分布于中國(guó)、印度等東南亞國(guó)家的溪流、池塘和稻田中，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值[13]。沈志民等[14]分離純化了黃鱔血清Tf，分析了其氨基酸組成；王博文等[15]分離純化了黃鱔血清Tf，得到了黃鱔血清Tf 蛋白，表征分析了其表面形態(tài)與二級(jí)結(jié)構(gòu)；雷華明等[16]克隆了黃鱔Tf 的C 端基因序列，進(jìn)行重組表達(dá)并制備了其多克隆抗體。但對(duì)黃鱔血清轉(zhuǎn)鐵蛋白Tf 基因全長(zhǎng)及其抑菌能力的研究尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。

本研究采用RACE-PCR 技術(shù)克隆了黃鱔血清Tf 全長(zhǎng)cDNA 序列，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，構(gòu)建了該基因N-lobe 的原核表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)了重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和分離純化，探究了黃鱔Tf 蛋白對(duì)腸道假單胞桿菌生長(zhǎng)的影響，為深入了解黃鱔血清Tf的功能積累基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌株

原核表達(dá)載體pET28a（Novagen 公司）；大腸桿菌感受態(tài)DH5α、BL21（DE3）、pEASY-T1 克隆載體等（北京全式金）；黃鱔腸道假單胞桿菌菌株由長(zhǎng)江大學(xué)生物醫(yī)藥研究所鑒定并保存。

1.1.2 主要試劑

小鼠抗6His-tag 單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG（Proteintech 公司）；硝酸纖維素膜、DAB 顯色試劑盒（武漢谷歌生物）；蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)粒DNA 提取試劑盒、瓊脂糖膠回收試劑盒、DNA 聚合酶（北京全式金）；Ni-NTA His·Bind Resin 親和柱（上海七海生物）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 黃鱔Tf 基因的克隆及序列分析

根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)人類（Homo sapiens，AAH59367.1）、小鼠（Mus musculus，NP_ 598738.1）和牙鲆（Paralichthys olivaceus，AAF33234.1）等不同物種的Tf 基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)基因簡(jiǎn)并性引物De-Tf-F 和De-Tf-R（表1），以黃鱔肝臟cDNA 為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收試劑盒純化后克隆至pEASY-T1 載體，選取陽(yáng)性菌落進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。將測(cè)序結(jié)果于NCBI 中比對(duì)，獲得Tf 保守區(qū)序列，再以該段序列作為模板設(shè)計(jì)特異性外側(cè)引物和內(nèi)側(cè)引物Tf-GSP5 和Tf-GSP3（表1），進(jìn)行5’-RACE 和3’-RACE 片段擴(kuò)增。根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用試劑盒進(jìn)行RACE-PCR 擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收試劑盒純化后，與pEASY-T1 載體連接，轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，挑取至少3 個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列測(cè)定驗(yàn)證。將所得cDNA 片段與5’和3’所得cDNA 末端拼接后即得到黃鱔Tf 基因全長(zhǎng)cDNA 序列。設(shè)計(jì)引物Orf-F 與Orf-R（表1）擴(kuò)增黃鱔Tf 開(kāi)放閱讀框并測(cè)定序列。利用NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)測(cè)序所得序列進(jìn)行氨基酸同源性比對(duì)，并采用MEGA4.0 軟件繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

表1 本研究中所用到的引物Tab.1 Primers used in this study

1.2.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)拼接后得到的黃鱔Tf 基因全長(zhǎng)cDNA 序列，設(shè)計(jì)基因特異性引物Rc-tf-F 和Rc-tf-R，以黃鱔肝臟cDNA 為模板擴(kuò)增黃鱔Tf 基因N 端序列。上下游引物分別添加EcoRⅠ與NotⅠ限制性酶切位點(diǎn)，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物與pET28a 載體進(jìn)行EcoRⅠ+NotⅠ雙酶切，回收的載體與基因按一定比例進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為pET28a/Tf-N。

1.2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將測(cè)序正確的pET28a/Tf-N 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB 平板（含50 μg/mL Kana）上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取單克隆接種于LB 培養(yǎng)基（含50 μg/mL Kana）中，37℃、220 r/min 振蕩培養(yǎng)至菌液OD600約為0.6 時(shí)，加入終濃度為0.1 mmol/L 的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），繼續(xù)37℃、220 r/min 誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h。SDS-PAGE 凝膠電泳檢測(cè)Tf-N 蛋白的表達(dá)結(jié)果。取200 μL 檢測(cè)表達(dá)的原菌液，加入200 mL LB 培養(yǎng)基中（含50 μg/mL Kana）中，擴(kuò)大培養(yǎng)至菌液OD600約為0.6 時(shí)，加入終濃度為0.1 mmol/L 的IPTG 誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h。誘導(dǎo)培養(yǎng)后的菌液4℃、10 000 r/min 離心10 min 收集菌體，加入5 mL PBS 緩沖液（50 mmol/L，pH8.3）重懸菌體。菌體重懸液置于冰上超聲波破碎15 min，破碎過(guò)程中每破碎5 s，間隔5 s。菌液4℃、10 000 r/min離心10 min，棄上清。沉淀中加入5 mL PBS 緩沖液（50 mmol/L，pH8.3，含6 mol/L 鹽酸胍）重懸，置于4℃靜置1 h 以上，4℃、10 000 r/min 離心10 min，收集上清。上清用0.45 μm 濾膜過(guò)濾后加入Ni-NTA His·Bind Resin 親和柱結(jié)合1 h 以上后，使上清自由流下，加入5 mL PBS 緩沖液（50 mmol/L，pH8.3，含6 mol/L 鹽酸胍，100 mmol/L 咪唑）洗脫蛋白。利用SDS-PAGE 凝膠電泳檢測(cè)Tf-N 蛋白的純化結(jié)果。

1.2.4 重組蛋白的Western blot 檢測(cè)

將經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)的含pET28a/Tf-N 重組菌的菌液與純化所得的Tf-N 蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，置于TBST緩沖液（含5%脫脂牛奶）中4℃封閉過(guò)夜，取出后用TBST 緩沖液洗膜3 次，每次10 min。隨即加入小鼠抗His-tag 單克隆抗體（1∶5 000），37℃孵育2 h，用TBST 洗膜3 次，每次10 min。最后，加入HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗（1∶10 000）于37℃孵育2 h，TBST 洗滌后用DAB 顯色劑顯色。以經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后的含pET28a 空質(zhì)粒菌株的菌液為陰性對(duì)照，以未經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后的含pET28a/Tf-N 重組菌的菌液為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.5 重組蛋白抑菌活性的檢測(cè)

挑取假單胞桿菌單克隆于3 mL LB 液體培養(yǎng)基中，30℃、220 r/min 振蕩培養(yǎng)6～8 h，使菌液OD600約為0.6。用ddH2O 將活化好的假單胞桿菌稀釋至105～106cell/mL 后，取100 μL 稀釋的菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基上，菌液稍干后放置牛津杯。用含3 mmol/L EDTA 的PBS 緩沖液（50 mmol/L，pH8.3）與不含EDTA 的PBS 緩沖液（50 mmol/L，pH8.3）分別將Tf-N 蛋白稀釋至180 μg/L、90 μg/L 和45 μg/L，各取稀釋的蛋白200 μL 加入固體培養(yǎng)基上的牛津杯中，隨后置于37℃培養(yǎng)過(guò)夜，觀察、測(cè)量抑菌圈直徑。用不含EDTA 的PBS 緩沖液（50 mmol/L，pH8.3）將加熱滅活的Tf-N 蛋白稀釋至180 μg/L、90 μg/L和45 μg/L，取200 μL 加入牛津杯中作為對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.6 重組蛋白對(duì)假單胞桿菌鐵獲取作用的影響

挑取假單胞桿菌單克隆于10 mL 液體LB 培養(yǎng)基中，于30℃、220 μg/L 條件下振蕩培養(yǎng)6～8 h，至菌液OD600約為0.6。實(shí)驗(yàn)分五組進(jìn)行，每組取30 μL上述假單胞桿菌菌液加入30 mL LB 液體培養(yǎng)基中，第一組不添加FeCl3與蛋白作為陰性對(duì)照；第二組只添加960 μL FeCl3（1 mmol/L）不添加蛋白作為陽(yáng)性對(duì)照；第三組中加入960 μL FeCl3（1 mmol/L）與100 μL Bfr 蛋白（100 μg/mL）；第四組中加入960 μL FeCl3（1 mmol/L）與100 μL Tf-N 蛋白（100 μg/mL）；第五組中加入960 μL FeCl3（1 mmol/L）、100 μL Bfr蛋白（100 μg/mL）與100 μL Tf-N 蛋白（100 μg/mL）。每組菌液補(bǔ)充ddH2O 至35 mL 后，置于30℃、220 μg/L 的條件下振蕩培養(yǎng)12 h，從培養(yǎng)3 h 起每隔1 h 取3 mL 菌液保存，每個(gè)時(shí)點(diǎn)的菌液取三次。用紫外分光光度計(jì)測(cè)量各時(shí)點(diǎn)菌液在600 nm 處的吸光值，以測(cè)量的吸光值表征菌液的生物量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃鱔Tf 基因序列

Tf cDNA（GenBank ID：AHA05992.1）全長(zhǎng)2 426 bp，5'UTR 與3'UTR 分別為33 bp 與329 bp，含有2 064 bp 的開(kāi)放閱讀框，編碼687 個(gè)氨基酸的多肽鏈，包含一個(gè)15 bp 的poly（A）尾（圖1）。

圖1 黃鱔Tf 基因的核苷酸序列及推斷的氨基酸序列Fig.1 The nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of swamp eel Tf gene

2.2 Tf 的同源性與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

利用MEGA6.0 和DNAMAN 軟件，將黃鱔和其他23 個(gè)物種的Tf 氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析（圖2）。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，黃鱔Tf 與其他魚(yú)類Tf 聚為一個(gè)分支，其中黃鱔與墨西哥脂鯉（Astyanax mexicanus）、青鳉（Oryzias latipes）、真鯛（Pagrosomus major）、大黃魚(yú)（Larimichthys crocea）等輻鰭亞綱物種進(jìn)化地位較為接近，與兩棲動(dòng)物、哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類和昆蟲(chóng)明顯親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)純化及鑒定

使用基因特異性引物對(duì)Rc-tf-F/R 從黃鱔肝臟cDNA 中擴(kuò)增獲得片段，雙酶切后與用同樣限制性內(nèi)切酶雙酶切的pET28a 連接，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21 感受態(tài)細(xì)菌，挑取陽(yáng)性菌株用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)。SDS-PAGE 電泳結(jié)果顯示，相對(duì)于轉(zhuǎn)空白質(zhì)粒的菌株與誘導(dǎo)前，誘導(dǎo)后產(chǎn)生了一條分子量約為33 kD 的條帶。通過(guò)Ni-NTA His Bind Resin 純化柱結(jié)合帶有His 標(biāo)簽的蛋白，用100 mmol/L 咪唑洗脫Tf-N 蛋白，SDS-PAGE 電泳檢測(cè)顯示純化后基本無(wú)雜蛋白（圖3-A）。將SDS-PAGE 凝膠中蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，分別用小鼠抗6His-tag 單克隆抗體為一抗和HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗進(jìn)行Western blot 免疫印跡顯示，帶有His 標(biāo)簽的融合蛋白被特異性識(shí)別，顯示了一條33 kD 的條帶，而對(duì)照組未產(chǎn)生反應(yīng)（圖3-B），說(shuō)明已成功實(shí)現(xiàn)了重組蛋白Tf-N 的表達(dá)及純化。

圖3 重組蛋白Tf-N 的SDS-PAGE 檢測(cè)（A）與Western blot 分析（B）Fig.3 SDS-PAGE（A）and Western blot（B）analysis of total protein Tf-N

2.4 Tf-N 蛋白對(duì)假單胞桿菌的抑制作用

在涂布假單胞桿菌的LB 固體培養(yǎng)基中加入Tf-N 蛋白，通過(guò)觀察測(cè)量抑菌圈的大小判斷Tf-N蛋白對(duì)假單胞桿菌的抑制作用。結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，在涂布假單胞桿菌的平板上加入活性Tf-N蛋白會(huì)產(chǎn)生抑菌圈，且隨著Tf-N 蛋白濃度的增加，抑菌圈大小增加（圖4-A）。當(dāng)加入的Tf-N 蛋白由含3 mmol/L EDTA 的PBS 緩沖溶液稀釋時(shí)，抑菌圈擴(kuò)增程度高于加入相同濃度由不含EDTA 的PBS緩沖溶液稀釋的Tf-N 蛋白（圖4-B）。結(jié)果表明，Tf-N 蛋白可以抑制假單胞桿菌的生長(zhǎng)，蛋白濃度越高抑制作用越顯著，同時(shí)EDTA 緩沖液對(duì)假單胞桿菌的生長(zhǎng)也有抑制作用。

圖4 黃鱔重組蛋白Tf-N 抑菌活性檢測(cè)Fig.4 The antimicrobial activities of recombinant Tf-N on Pseudomonas spp.

2.5 Tf-N 蛋白對(duì)假單胞桿菌生長(zhǎng)的影響

在假單胞桿菌菌液中外源添加Fe3+、Tf-N 蛋白與Bfr 蛋白，通過(guò)吸光值表征法測(cè)定假單胞桿菌培養(yǎng)不同時(shí)間的生物量，從而判斷Tf-N 蛋白對(duì)假單胞桿菌生長(zhǎng)的影響。結(jié)果顯示：外源添加Fe3+的情況下，在假單胞桿菌菌液中單獨(dú)加入100 μL Bfr 蛋白（100 μg/mL）會(huì)促進(jìn)假單胞桿菌的生長(zhǎng)；而單獨(dú)加入100 μL Tf-N 蛋白（100 μg/mL）后，卻一定程度上抑制了假單胞桿菌的生長(zhǎng)。將Bfr 蛋白（100 μg/mL）與Tf-N 蛋白（100 μg/mL）同時(shí)添加100 μL 于假單胞桿菌菌液中時(shí)，可促進(jìn)假單胞桿菌的生長(zhǎng)，且其促進(jìn)作用顯著高于僅加入Bfr 蛋白時(shí)對(duì)假單胞桿菌生長(zhǎng)的影響（圖5）。

圖5 不同時(shí)點(diǎn)假單胞桿菌OD600Fig.5 Pseudomonas spp.OD600 values in different time

3 討論

轉(zhuǎn)鐵蛋白（Tf）由N 端和C 端兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，并由中間的短鏈接區(qū)連接，兩個(gè)結(jié)構(gòu)域具有非常高的同源性，每個(gè)結(jié)構(gòu)域都能結(jié)合一個(gè)金屬離子[17]。Tf的主要作用是將鐵離子安全地運(yùn)送到身體各處，為生長(zhǎng)中的細(xì)胞提供所需的鐵元素[18]。本實(shí)驗(yàn)克隆了黃鱔血清Tf 基因，序列分析表明，黃鱔Tf 基因和其他脊椎動(dòng)物一樣具有N 端和C 端2 個(gè)結(jié)構(gòu)域，并與其他魚(yú)類Tf 基因有較高的同源性。在此基礎(chǔ)上，筆者利用黃鱔Tf 基因N 端序列構(gòu)建了表達(dá)載體，誘導(dǎo)純化了33 kD 的重組蛋白Tf-N，為進(jìn)一步探究黃鱔轉(zhuǎn)鐵蛋白抑菌等功能奠定基礎(chǔ)。

鐵是生物體內(nèi)含量最豐富的過(guò)渡金屬，大多數(shù)生物體使用鐵作為多種代謝酶的重要輔因子，而鐵在富氧條件下也會(huì)產(chǎn)生毒性，因而精確地維持鐵的穩(wěn)態(tài)對(duì)于細(xì)菌的生存是必要的[19]。對(duì)于宿主而言，控制病原菌對(duì)自身鐵的利用是抵抗病原菌侵染的有效途徑之一[20]。本研究結(jié)果表明，Tf-N 蛋白可以抑制假單胞桿菌的生長(zhǎng)，同時(shí)EDTA 對(duì)假單胞桿菌的生長(zhǎng)也有抑制作用。EDTA 可以和幾乎所有的過(guò)渡金屬離子生成穩(wěn)定的水溶性螯合物，通過(guò)螯合金屬離子，破壞細(xì)菌維持生存所需的金屬環(huán)境穩(wěn)態(tài)[21]。本研究證實(shí)了只采用黃鱔血清Tf 基因N 端序列重組表達(dá)的蛋白仍然具有抑菌作用，推測(cè)Tf-N 蛋白的抑菌作用來(lái)源于其螯合鐵特性，Tf-N 蛋白通過(guò)結(jié)合鐵離子并打破細(xì)菌的鐵穩(wěn)態(tài)，從而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。

Bfr 是細(xì)菌體內(nèi)重要的儲(chǔ)鐵蛋白，在鐵過(guò)量條件下結(jié)合Fe3+從而維持細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)的鐵穩(wěn)態(tài)[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)外源性添加Tf-N 蛋白對(duì)假單胞桿菌的生長(zhǎng)有抑制作用，而將Bfr 蛋白與Tf-N 蛋白等濃度加入假單胞桿菌中時(shí)，可促進(jìn)假單胞桿菌的生長(zhǎng)，且其促進(jìn)作用顯著高于僅加入Bfr 時(shí)對(duì)假單胞桿菌生長(zhǎng)的影響。我們推測(cè)，在鐵過(guò)量條件下，宿主利用Tf-N 蛋白鐵螯合特性達(dá)到抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的目的[11]，而細(xì)菌體內(nèi)特有的Bfr 通過(guò)與Tf-N 蛋白相互作用，利用Tf-N 蛋白的鐵結(jié)合能力，達(dá)到結(jié)合過(guò)量Fe3+維持細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)鐵穩(wěn)態(tài)的目的，從而促進(jìn)細(xì)菌的生長(zhǎng)。Tf 和Bfr 的相互作用，以及Tf 的抗菌機(jī)理仍需進(jìn)一步的探索與驗(yàn)證。