馮艷琴，沈輝，王興強(qiáng)，蔣葛，喬毅，李吉云,3

（1.江蘇海洋大學(xué)，江蘇 連云港 222000；2.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇 南通 226007；3.南京師范大學(xué)，江蘇 南京 210000）

近年來，對蝦急性肝胰腺壞死病（Acute hepatopancreas necrosis disease，AHPND）自2009 年暴發(fā)以來，相繼在越南、馬來西亞、泰國以及菲律賓等國家流行[1,2]。該病感染凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）引起對蝦空腸空胃、肝胰腺萎縮及糜爛，短時間內(nèi)出現(xiàn)較高的致死率，具有較強(qiáng)傳染性[3]。2011年該病使越南約70%的凡納濱對蝦養(yǎng)殖受到損失，我國華南地區(qū)凡納濱對蝦產(chǎn)量也下降80%以上，泰國凡納濱對蝦產(chǎn)量減半。該病原為攜帶PriA 和PriB二元毒力蛋白的一類弧菌，以副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus,VP）最為常見[4,5]。

目前，針對AHPND 沒有非常有效的防控措施，養(yǎng)殖過程中常以水體消毒、抗生素和蛭弧菌使用為主[6，7]。相關(guān)研究表明，氟苯尼考對AHPND 有短期抑制效果[8]，但抗生素的使用會破壞蝦體腸道菌群穩(wěn)定性，迅速誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[9]。目前，關(guān)于AHPND 的研究主要集中在病理方面，其防治措施的研究還較少。近年來，利用拮抗菌抑制及防治病原菌逐漸成為新的生態(tài)防控趨勢[10，11]，主要利用微生物產(chǎn)生特殊的代謝產(chǎn)物或改變環(huán)境條件來抑制,甚至殺死另一種微生物的機(jī)制，在病害防治中發(fā)揮重大作用[12]。鄧書香[13]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)斑馬魚（Danio rerio）受到副溶血性弧菌急性感染時，地衣芽孢桿菌具有一定的保護(hù)效果。乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）可針對細(xì)角濱對蝦（Litopenaeus stylirostris）的夏季弧菌性敗血癥，使蝦體中的弧菌數(shù)量明顯降低[14]。

本研究擬從江蘇沿海海域海水、沉積物及海洋生物體中篩選鑒定出對致急性肝胰腺壞死病的副溶血性弧菌（VPAHPND）具有抑制作用的拮抗菌，研究其拮抗能力及其活性物質(zhì)，以期為AHPND 防控提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用VPAHPND菌株采自2017—2020 年患該病的南美白對蝦肝胰腺組織，快速取出后，超低溫凍存（-80℃），對其感染的VPAHPND分離鑒定后保存于江蘇省海洋水產(chǎn)研究所菌庫中。2018 年采集江蘇沿海海域水樣、沉積物及海洋生物體等樣品，分離、篩選及鑒定拮抗菌。

細(xì)菌微量生理生化反應(yīng)鑒定管購自杭州濱河微生物試劑有限公司；16S rDNA 擴(kuò)增通用引物27F/1492R、gyrB 引物up-1s/up-2Sr 等由上海生工生物有限公司進(jìn)行基因合成。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌的分離篩選與保存

用LB、2216E、高氏一號三種培養(yǎng)基分離細(xì)菌，固體平板于28℃恒溫培養(yǎng)24 h，液體純化培養(yǎng)后加入無菌甘油至終濃度20%，-80℃凍存。通過抑菌圈法并做微調(diào)后篩選拮抗菌的活性[15]。具體操作如下：將篩選得到的菌株于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，取5 μL 菌液滴加至無菌空白藥敏紙片中，4℃保存待用，以滴加5 μL 滅菌生理鹽水制作的紙片作為空白對照；將VPAHPND復(fù)蘇調(diào)至菌體濃度為5.0×106cfu·mL-1，用無菌脫脂棉蘸取菌液涂布于瓊脂培養(yǎng)基平皿表面，待其晾干備用；將制備好的藥敏紙片貼在涂有VPAHPND的瓊脂培養(yǎng)基表面，每組三個重復(fù)，28℃倒置培養(yǎng)24 h 后觀測抑菌圈，篩選拮抗菌株。

1.3 拮抗菌的鑒定

1.3.1 細(xì)菌形態(tài)學(xué)特征觀察和生理生化鑒定

對篩選后的拮抗菌進(jìn)行革蘭氏染色，顯微觀察菌體的結(jié)構(gòu)特征。參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》對篩選的菌株進(jìn)行生理生化鑒定。

1.3.2 分子生物學(xué)鑒定

采用煮沸法提取菌株基因組DNA，通過PCR擴(kuò)增其16S rDNA 和gyrB 基因，引物信息見表1，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%濃度瓊脂糖電泳檢測。挑選具有目標(biāo)條帶同等大小的產(chǎn)物外送測序，獲得的序列進(jìn)行Blast 同源性比對分析，并使用MEGA7.0 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 實(shí)驗(yàn)用引物詳細(xì)信息Tab.1 Primer details used in the experiment

1.4 拮抗試驗(yàn)及活性物質(zhì)初步研究

1.4.1 活性物質(zhì)來源定位

按照表2 進(jìn)行處理分組[18]，每組三個重復(fù)，各處理組以28℃、150 r·min-1培養(yǎng)24 h。取不同處理組的液體開展拮抗實(shí)驗(yàn)，觀察記錄不同菌株對VPAHPND的拮抗活性。

表2 不同處理組VPAHPND 拮抗菌活性物質(zhì)來源定位Tab.2 The sources of active substances of VPAHPND antagonistic bacteria in different treatment groups

1.4.2 活性物質(zhì)成分分析

按照表3 對H36 的上清液進(jìn)行分組處理[18]，每組三個重復(fù)。將篩選獲得的拮抗菌用相應(yīng)的液體培養(yǎng)基在28℃、150 r·min-1下培養(yǎng)24 h 后，取不同處理組的液體測定對VPAHPND的抑菌活性，測試拮抗能力并記錄拮抗效果。

表3 不同處理組活性物質(zhì)成分分析Tab.3 Different treatment groups for active substance composition analysis

1.4.3 活性物質(zhì)粗提

分別取10 mL 拮抗菌發(fā)酵上清液處理組2，加入硫酸銨，使上清液硫酸銨飽和度分別達(dá)20%～80%，靜置沉降過夜。10 000 r·min-1離心10 min，收集絮狀沉淀，100 μL 無菌水溶解沉淀并測定其抑菌活性。選擇以上最適硫酸銨飽和度分離活性物質(zhì)，用無菌水溶解得到抗菌活性物質(zhì)粗提物。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用IBM SPSS 26.0 軟件、Excel 軟件和Origin 2019 軟件統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析（ONE-WAY ANVOA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異性檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌的抑菌活性測定

本實(shí)驗(yàn)從多批樣品中分離獲得152 株細(xì)菌，其中編號為H36 的菌株對VPAHPND菌的抑菌活性較高。H36 對五株不同來源的VPAHPND具有不同效果的拮抗作用（表4）。

表4 菌株H36 對五株VPAHPND 的抑菌效果Tab.4 Antibacterial effect of strain H36 on VPAHPND

2.2 拮抗菌的鑒定

2.2.1 菌株的形態(tài)特征觀察及生理生化鑒定

H36 菌株在固體LB 培養(yǎng)基上的菌落為圓形淡黃色或乳白色、邊緣有褶皺、表面粗糙不光滑且不透明（圖1-a）；在液體培養(yǎng)基中靜止培養(yǎng)時有菌膜形成。H36 為革蘭氏陽性、長桿菌（圖1-b）。菌株H36 生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5，根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》，初步鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillus）。

圖1 菌株H36 的形態(tài)特征觀察（a）及革蘭氏染色圖（b）Fig.1 Observation of the morphological characteristics（a）and Gram stain of strain H36（b）

表5 生理生化鑒定Tab.5 Biochemical identification of strain H36 in the test

2.2.2 16S rDNA 基因序列分析以及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將測得的序列提交到NCBI 數(shù)據(jù)庫中，登錄號為MW007833。序列經(jīng)比對產(chǎn)物大小為1 451 bp，發(fā)現(xiàn)其與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）和特基拉芽孢桿菌（Bacillus tequilensis）等同源性為99%，基于16S rDNA 基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2-a）。H36 與枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和特基拉芽孢桿菌等聚為一支。

圖2 基于16S rDNA（a）和gyrB（b）的菌株H36 的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain H36 based on 16S rDNA sequence and gyrB sequence

2.2.3 gyrB 基因序列分析以及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

擴(kuò)增H36 的gyrB 基因，獲得了分子量約1 200 bp 的產(chǎn)物，序列經(jīng)Blast 比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2-b）。結(jié)果顯示：拮抗菌H36 與枯草芽孢桿菌（CP002183.1）聚類為一支。結(jié)合菌落形態(tài)特征、生理生化鑒定、16S rDNA 基因和gyrB 基因擴(kuò)增分析，H36 菌株鑒定為枯草芽孢桿菌。

2.3 拮抗菌抑菌物質(zhì)的定位及活性成分的初步判斷

2.3.1 拮抗菌H36 抑菌物質(zhì)的來源定位

拮抗菌H36 菌液拮抗能力如圖3-a 所示。處理組2 和處理組3 與陽性對照組具有明顯抑菌圈，處理組4 和處理組5 未出現(xiàn)抑菌圈。由此表明，H36 菌株對VPAHPND 具有良好的拮抗效果，其拮抗活性物質(zhì)主要存在細(xì)菌胞外發(fā)酵產(chǎn)物中。

圖3 拮抗菌H36 上清液不同處理組對VPAHPND 的抑制作用（序號對應(yīng)不同處理組）Fig.3 Inhibition of different treatment groups of antagonistic H36 supernatant on VPAHPND（serial number corresponds to different processing groups）

2.3.2 拮抗菌H36 抑菌物質(zhì)活性成分的初步判斷

拮抗菌H36 發(fā)酵上清液不同處理組的抑菌結(jié)果如圖3-b 所示。不同處理組的抑菌活性明顯不同，經(jīng)95℃高溫處理后（處理組3）仍具有明顯的抑菌活性，處理組4 經(jīng)蛋白酶K 處理后抑菌活性丟失，表明抑菌活性物質(zhì)以蛋白類為主。

2.4 拮抗菌H36 產(chǎn)生的活性物質(zhì)的粗提取

H36 發(fā)酵上清液隨著硫酸銨飽和度的增大，沉淀的抗菌活性逐漸增強(qiáng)（圖4）。在20%飽和鹽濃度下抗菌蛋白就開始部分析出，當(dāng)飽和度為70%時，沉淀的抑菌活性達(dá)到最高，表明抗菌活性物質(zhì)在70%硫酸銨飽和度時幾乎達(dá)到了最佳沉淀度。

圖4 拮抗菌H36 上清液在不同濃度硫酸銨沉淀后沉淀溶解液的抑菌活性Fig.4 Antibacterial activity of antagonistic H36 supernatant after precipitation with different concentrations of ammonium sulfate

3 討論

本研究中篩選到一株編號為H36 對VPAHPND具有較高抑菌活性的拮抗菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定初步認(rèn)定為一類能產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性細(xì)菌。16S rDNA 基因序列分析表明，H36 與枯草芽孢桿菌、特基拉芽孢桿菌（Bacillus tequilensis）等有較高相似性。在菌種鑒定研究中，16S rDNA 基因序列分析較難區(qū)別親緣關(guān)系接近的菌種[19]。Wang 等[20]比較了16S rDNA 基因gyrB 基因序列，發(fā)現(xiàn)枯草群各種、亞種的gyrB 基因相似性在75%～95%之間，表現(xiàn)出比16S rDNA 有更好的區(qū)分效果。本研究采用編碼蛋白gyrB 基因[17,21]，鑒定菌株H36 的分類地位，發(fā)現(xiàn)其為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

Balcazar 等[22]從凡納濱對蝦腸道分離到對副溶血性弧菌有抑制作用的枯草芽胞桿菌UTM126。該菌對溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）和哈氏弧菌（V.harveyi）也有明顯的拮抗作用。楊勝遠(yuǎn)等[23]篩選出的一株枯草芽胞桿菌JNT02。該菌株在改良蘭迪培養(yǎng)基中24 h 可完全殺滅共培養(yǎng)的副溶血性弧菌，其培養(yǎng)液的抗菌物質(zhì)對其拮抗作用有累積效應(yīng)。本研究中，拮抗菌株H36 的發(fā)酵菌液離心后的沉淀無明顯抑菌活性，而上清液以及濾過液都有抑菌活性，說明其抑菌作用的活性物質(zhì)為胞外產(chǎn)物。韋露等[24]研究發(fā)現(xiàn)，加入等量短小芽胞桿菌（Bacillus pumilus）B1 的細(xì)菌胞外產(chǎn)物可顯著抑制副溶血性弧菌的生長，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致。劉雪飛[25]通過分離、篩選和鑒定，獲得兩株對副溶血性弧菌有拮抗作用的潛在益生菌—短小芽胞桿菌和莫海威芽胞桿菌（Bacillus mojavensis），這兩株拮抗菌都能分泌胞外酶，抗菌譜廣，抑菌試驗(yàn)效果良好。

枯草芽孢桿菌具有數(shù)十種抗菌物質(zhì)，主要有抗菌肽（bacitracin）[26]、大環(huán)脂（cycleopetite）[27,28]，不同成分組成的蛋白性的抗菌物質(zhì)[29]。本研究中，經(jīng)蛋白酶K 處理后，明顯喪失對VPAHPND的抑菌活性，表明H36 的抗菌物質(zhì)為蛋白類活性物質(zhì)。在已有的研究中，枯草芽孢桿菌大部分活性物質(zhì)都耐高溫[30]。郝彥利等[31]對枯草芽孢桿菌的粗提液進(jìn)行5 種蛋白酶處理，發(fā)現(xiàn)經(jīng)木瓜蛋白酶、蛋白酶K 處理后，菌株粗提液的抑菌活性完全消失，初步鑒定此粗提液為蛋白質(zhì)性質(zhì)。關(guān)于細(xì)菌分泌到胞外的抑菌活性成分的分離純化及性質(zhì)的研究報(bào)道有很多[32,33]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在飽和度70%時抑菌效果最高。灑榮波[34]的研究也驗(yàn)證了這一點(diǎn)，用70%飽和度的硫酸銨鹽析枯草芽孢桿菌，上清液的抗菌活性極低，說明絕大部分抗菌活性物質(zhì)已經(jīng)被沉淀下來，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。本研究中H36 初步分析結(jié)果與以上研究較為類似，但其活性物質(zhì)的鑒定還需要進(jìn)一步分析。

枯草芽孢桿菌是一種應(yīng)用十分廣泛的益生菌，能維持機(jī)體腸道微生態(tài)平衡，提升機(jī)體免疫水平[35]。目前關(guān)于拮抗菌的研究主要集中在對病原菌具有顯著抑制作用的益生菌篩選研究上，但是，在基于AHPND 原菌拮抗菌的活性物質(zhì)還沒有廣泛深入的研究[36]。本實(shí)驗(yàn)明確枯草芽孢桿菌H36 對VPAHPND有明顯抑菌活性，H36 產(chǎn)生的活性物質(zhì)耐高溫，且包含蛋白質(zhì)類。該結(jié)果豐富了VPAHPND的拮抗菌的研究。發(fā)酵也是微生物獲得活性物質(zhì)的重要途徑，因此下一步將研究拮抗菌發(fā)酵液的發(fā)酵條件。該拮抗菌的具體活性物質(zhì)及其活性物質(zhì)耐受條件還有待于探索。