劉霞飛，楊合霖，豐超杰，呂偉華，張穎

（1.大連海洋大學(xué)，遼寧 大連 116023；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070）

達(dá)氏鰉（Huso dauricus）隸屬于鱘科（Acipenseridae）、鰉屬（Huso），是世界現(xiàn)存2 種鰉屬最大型淡水魚類之一，最大個體可達(dá)1 000 kg 以上[1]。達(dá)氏鰉為黑龍江特有珍稀名貴魚類，經(jīng)濟(jì)價值較高，其卵制成的魚子醬被稱為“黑黃金”，與松露、鵝肝并稱為世界三大美食。20 世紀(jì)80 年代后，受過度捕撈、環(huán)境污染及水利工程等因素的影響，達(dá)氏鰉的野生資源量急劇下降，瀕危狀況十分嚴(yán)重[1]。目前，達(dá)氏鰉已為國家Ⅰ級保護(hù)物種。達(dá)氏鰉性成熟遲、群體年齡復(fù)雜、幼魚成活率低、補(bǔ)充群體小等，資源一旦遭到破壞，很難恢復(fù)，恢復(fù)期長達(dá)幾十年。因此，有關(guān)達(dá)氏鰉保護(hù)生物學(xué)的相關(guān)研究對其物種保護(hù)十分重要[1]。

血細(xì)胞是機(jī)體免疫的重要組成成分，不僅參與吞噬、分泌等功能，還參與機(jī)體的傷口修復(fù)、防御等生理機(jī)制，對自身生理狀態(tài)變化和對外界環(huán)境因子刺激非常敏感,在維持機(jī)體生理穩(wěn)態(tài)方面具有重要作用[1]。魚類血細(xì)胞的形態(tài)、數(shù)量、結(jié)構(gòu)和功能具有種屬差異性和環(huán)境差異性其。目前，已研究了中華鱘（Acipenser sinensis）[1，4]、高首鱘（A.transmontanus）[1，6]、雜交鱘（Huso dauricus ♀×Acipenser schrenckii ♂）[1，7]和施氏鱘（A.schrenckii）[1，8]等魚類血細(xì)胞組成、發(fā)生及功能等，但有關(guān)于達(dá)氏鰉血細(xì)胞的研究僅有外周血細(xì)胞的形態(tài)學(xué)[1，9]。本研究觀察和分析了達(dá)氏鰉血細(xì)胞的組成、發(fā)生和吞噬功能，為達(dá)氏鰉血細(xì)胞的研究提供更多的基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用達(dá)氏鰉1 齡魚，平均體長為（359±37.269）mm，平均體質(zhì)量為（324.24±214.7）g，來自中國水產(chǎn)科學(xué)院黑龍江水產(chǎn)研究所呼蘭試驗站，暫養(yǎng)在水溫（14.3±2.2）℃，溶解氧≥6 mg/L，循環(huán)水和增氧條件下，取健康個體進(jìn)行實驗。

1.2 方法

1.2.1 顯微結(jié)構(gòu)觀察

取健康個體，用1 mL 一次性無菌注射器從尾椎靜脈取血，血液與肝素鈉（1%）混合，涂片，空氣中干燥后，用2.5%戊二醛固定，Wright's 染色，中性樹膠封片。Leica 顯微鏡油鏡觀察、拍照，并選取5 張涂片測定血細(xì)胞大小，每種測定50 個細(xì)胞，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±SD）表示。

1.2.2 酵母吞噬實驗

1.2.2.1 制備酵母液

將1 g 高活性酵母用蒸餾水定容至15 mL 作為酵母液，然后高壓鍋120℃滅菌30 min，待稍冷卻后，置于25～30℃培養(yǎng)箱中，1～2 d 后3 000 r/min，4℃離心2 min，去上清，滅菌生理鹽水懸浮，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用前稀釋[1，10]。

1.2.2.2 制備血液

尾椎靜脈取血后快速加入肝素鈉抗凝，用0.1 mol/L PBS 稀釋[1，10]。

1.2.2.3 血細(xì)胞酵母吞噬實驗

將上述調(diào)整濃度后的血液和酵母液加入滅菌后的離心管中，充分混合30 s，30℃恒溫水浴鍋40 min。孵育完成后涂片，待干燥后用2.5%戊二醛固定6 min，Wright's 染色、封片。隨機(jī)取3 尾魚進(jìn)行血細(xì)胞吞噬實驗，每尾魚制作2 張涂片，每張統(tǒng)計50 個細(xì)胞中吞噬酵母菌的個數(shù)，計算吞噬率[（吞噬酵母的紅細(xì)胞數(shù)÷計數(shù)總紅細(xì)胞數(shù)）×100%]。接觸酵母自身變形甚至伸出偽足或胞漿內(nèi)含有酵母的為吞噬的紅細(xì)胞。

1.2.3 達(dá)氏鰉血細(xì)胞的發(fā)生

擦凈魚體表面，間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽（MS-222）麻醉魚體后解剖，取出魚的頭腎、體腎、脾臟和肝臟，用生理鹽水清洗表面的血漬，用吸水紙吸干，用刀片將每個器官橫切，將切面輕輕與玻片接觸，迅速制取切片。每尾魚各器官各制作印跡片10 張，待干后用Wright's 染液染1～2 min，加入磷酸緩沖液浸泡3～5 min，用蒸餾水浸泡沖洗5～7 min，晾干。中性樹膠封片。

每張印片隨機(jī)取5 個視野，對各個細(xì)胞系按照不同的發(fā)育階段進(jìn)行描述，分類計數(shù)[11]。用Leica 顯微鏡油鏡觀察并拍照，隨機(jī)選擇各10 個細(xì)胞測量長徑和短徑。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±SD）表示，用Excel 2016 軟件處理，照片用Adobe Photoshop19.0處理，同比例縮放圖像和標(biāo)尺。

2 結(jié)果與分析

2.1 各類細(xì)胞的組成及發(fā)育過程

達(dá)氏鰉外周血細(xì)胞可以分為紅細(xì)胞和白細(xì)胞，其中白細(xì)胞包括嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和血栓細(xì)胞，未觀察到嗜堿性粒細(xì)胞（圖1）。頭腎、體腎、脾臟、肝臟組織印片中各類血細(xì)胞大小測量結(jié)果如表1 所示，血細(xì)胞分類及發(fā)育階段參照Fijan[12]所推薦的標(biāo)準(zhǔn)。

表1 達(dá)氏鰉血細(xì)胞的大小和白細(xì)胞分類計數(shù)值（x±SD）Tab.1 Size of different blood cells and counts of differential leucocytes（DLC）of huso sturgeon H.dauricus

2.1.1 紅細(xì)胞

血涂片中主要以紅細(xì)胞為主。達(dá)氏鰉紅細(xì)胞呈卵圓形，表面光滑無突起。核呈圓形或橢圓形，著色深，位于細(xì)胞的一側(cè)或偏向細(xì)胞一側(cè)。胞質(zhì)著色淺。外周血細(xì)胞中，可以觀察到早期成熟紅細(xì)胞（圖1-c），細(xì)胞和核呈圓形，位于細(xì)胞中央（圖1-a）。

印片結(jié)果顯示，達(dá)氏鰉原紅細(xì)胞，呈圓形或橢圓形，細(xì)胞體較大且胞質(zhì)少。細(xì)胞核相對較大，占據(jù)細(xì)胞的大部分，位于胞質(zhì)中央或一側(cè)，核膜明顯（圖2-o）。其幼紅細(xì)胞，可以分為早、中、晚幼紅細(xì)胞三個發(fā)育時期。三個發(fā)育期的胞體均小于原紅細(xì)胞。三種紅細(xì)胞均呈圓形或橢圓形，表面均光滑，少有突起，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，位于細(xì)胞中央或偏向一側(cè)。

2.1.2 粒細(xì)胞

達(dá)氏鰉嗜中性粒細(xì)胞呈圓形或橢圓形，胞質(zhì)著色淺。細(xì)胞核呈多葉形，腎形或馬蹄形，常偏于細(xì)胞一側(cè)或與細(xì)胞膜相切著色深（圖1-c）。嗜酸性粒細(xì)胞呈圓形，在血涂片中數(shù)量極少，其細(xì)胞表面有較大且著色深的圓形顆粒，細(xì)胞核呈腎形或多葉形（圖1-c），常位于細(xì)胞一側(cè)（圖1-b）。

印片結(jié)果中的原粒細(xì)胞呈圓形或卵圓形，表面光滑，胞質(zhì)藍(lán)色。細(xì)胞核占據(jù)細(xì)胞的2/3～4/5，呈圓形或卵圓形，有一側(cè)與膜相切或靠近（圖2-p）。早幼粒細(xì)胞呈圓形或卵圓形，細(xì)胞質(zhì)有嗜天青顆粒出現(xiàn)。細(xì)胞核呈橢圓形，偏于細(xì)胞一側(cè)，約占細(xì)胞的1/2，早幼粒細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)較深（圖2-t）。

從中幼粒細(xì)胞開始，細(xì)胞內(nèi)的嗜天青顆粒的數(shù)量逐漸減少，有較多的特殊性顆粒，可以根據(jù)特殊性顆粒明顯區(qū)分兩種不同的粒細(xì)胞。嗜中性中幼粒細(xì)胞細(xì)胞呈圓形或橢圓形，細(xì)胞核偏于細(xì)胞一側(cè)，核內(nèi)染色質(zhì)聚集明顯（圖2-q）。嗜酸性中幼粒細(xì)胞呈圓形或橢圓形，體積比嗜中性中幼粒細(xì)胞小，細(xì)胞核偏于細(xì)胞一側(cè)（圖2-w）。

晚幼粒細(xì)胞呈圓形或橢圓形，根據(jù)特殊性顆粒顏色可以分為嗜中性晚幼粒細(xì)胞和嗜酸性晚幼粒細(xì)胞。嗜中性晚幼粒細(xì)胞比中幼粒細(xì)胞體積要小，呈圓形或橢圓形，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)濃縮集聚，充滿無色顆粒，形狀多樣，為不規(guī)則的圓形，桿狀，偏于細(xì)胞一側(cè)（圖2-w）。嗜酸性晚幼粒細(xì)胞比中幼粒細(xì)胞體積要小，呈圓形，其細(xì)胞核形態(tài)多樣，有圓形，腎形或分葉形，常偏于細(xì)胞一側(cè)。胞質(zhì)集聚染色質(zhì)呈塊狀，嗜酸性顆粒增多（圖2-v）。

成熟粒細(xì)胞呈圓形或橢圓形，細(xì)胞形態(tài)與晚幼粒細(xì)胞形態(tài)相似，但是體積比晚幼粒細(xì)胞要小，嗜中性和嗜酸性成熟粒細(xì)胞細(xì)胞核均偏于細(xì)胞一側(cè)，與細(xì)胞膜相切，染色質(zhì)有大量的特異性顆粒。

2.1.3 單核細(xì)胞

外周血細(xì)胞中單核細(xì)胞呈圓形，有的會有多個偽足突起，是白細(xì)胞中最大的細(xì)胞。細(xì)胞核呈圓形或腎形，占據(jù)整個細(xì)胞的1/2 左右，位于細(xì)胞中央或一側(cè)（圖1-b）。

根據(jù)印片中結(jié)果可見，原單核細(xì)胞體積大，是所有原血細(xì)胞中體積最大的，呈圓形，細(xì)胞核呈不規(guī)則形，偏于細(xì)胞一側(cè)（圖2-r）。幼單核細(xì)胞呈圓形或不規(guī)則形，體積比原單核細(xì)胞小，有偽足狀的突起，有的胞漿內(nèi)有少量細(xì)小的嗜天青顆粒出現(xiàn)（圖2-s）。

2.1.4 淋巴細(xì)胞

大淋巴細(xì)胞呈圓形或橢圓形，表面有許多類似絨毛一樣的突起，細(xì)胞核較大，基本上占滿整個胞質(zhì)（圖1-b）。小淋巴細(xì)胞呈圓形、橢圓形或不規(guī)則形，有明顯的向外伸出的偽足狀的表面突起，細(xì)胞核占據(jù)胞質(zhì)的2/3 左右（圖1-c）。

原淋巴細(xì)胞呈圓形或橢圓形，偶見偽足突起，是最小的原血細(xì)胞。胞質(zhì)嗜堿性呈藍(lán)色且少。細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，占細(xì)胞體積的大部分（圖2-r）。幼淋巴細(xì)胞呈圓形或橢圓形，胞質(zhì)較原淋巴細(xì)胞有所增多，偶見偽足，有嗜天青顆粒，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形（圖2-r）。根據(jù)淋巴細(xì)胞的大小可以分為大淋巴細(xì)胞和小淋巴細(xì)胞。兩者經(jīng)?？梢杂^察到有胞突，細(xì)胞質(zhì)少，有些只能觀察到輪廓甚至幾乎沒有。

圖2 達(dá)氏鰉血細(xì)胞發(fā)生Fig.2 Hematopoiesis in different developmental stages in huso sturgeon H.dauricu

2.1.5 血栓細(xì)胞

血栓細(xì)胞呈圓形或橢圓形，表面光滑。細(xì)胞核呈橢圓形或桿狀或腎形，位于細(xì)胞中央。細(xì)胞質(zhì)極少，部分細(xì)胞呈裸核狀。常見2 個及2 個以上的細(xì)胞聚集在一起（圖1-a）。

圖1 達(dá)氏鰉外周血細(xì)胞Fig.1 Peripheral blood cells of huso sturgeon H.dauricus

2.2 三種組織中各種血細(xì)胞的比例

頭腎、體腎、肝臟和脾臟4 種組織中，各種血細(xì)胞原始，幼稚和成熟階段數(shù)量占總數(shù)的比例見表2。其中，原紅細(xì)胞在頭腎中比例最大，為1.63%，其次是體腎、脾臟，為0.89%和0.56%，肝臟中未見；原始粒細(xì)胞在體腎和頭腎中比例大，分別為1.47%和2.45%，在脾臟和肝臟中也存在，但是比例比較低；原淋巴細(xì)胞在脾臟中所占比例要比其他器官高，為1.57%，其次是頭腎和體腎；原單核細(xì)胞在頭腎中所占比例最大，為1.33%，其次是體腎，為1.21%。成熟紅細(xì)胞在肝臟中所占比例最大，為88.71%；成熟粒細(xì)胞在頭腎和體腎中所占比例較大，在肝臟和脾臟中所占比例較少。因此達(dá)氏鰉的紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞主要發(fā)生在頭腎和體腎，淋巴細(xì)胞主要發(fā)生在脾臟。

表2 4 種組織中不同血細(xì)胞的百分比/%Tab.2 Percentage of different blood cells in 4 kinds of tissues

2.3 血細(xì)胞吞噬酵母的觀察

吞噬實驗表明，達(dá)氏鰉血細(xì)胞中紅細(xì)胞具有吞噬能力，且粒細(xì)胞和單核細(xì)胞都有吞噬、黏附酵母的現(xiàn)象。實驗?zāi)苡^察到血細(xì)胞吞噬酵母的多種現(xiàn)象：①紅細(xì)胞靠近酵母細(xì)胞，伸出偽足牽引酵母細(xì)胞（圖3-f）；②吞噬完1 個酵母細(xì)胞的紅細(xì)胞仍然可以黏附酵母細(xì)胞（圖3-h）；③黏附酵母的紅細(xì)胞的細(xì)胞膜明顯凹陷（圖3-h）；④紅細(xì)胞可黏附兩個及多個酵母細(xì)胞（圖3-i）；⑤也存在兩個紅細(xì)胞黏附同一個酵母細(xì)胞（圖3-j）。紅細(xì)胞的吞噬率為（22.84±3.21）%。

圖3 達(dá)氏鰉血細(xì)胞吞噬酵母現(xiàn)象Fig.3 Phagocytotic yeasts of blood cells in huso sturgeon H.dauricus

3 討論

3.1 達(dá)氏鰉外周血細(xì)胞的組成特征

與齊口裂腹魚[13]、成年似鲇高原鰍[14]等魚類的血細(xì)胞組成一樣，達(dá)氏鰉的外周血細(xì)胞由紅細(xì)胞，粒細(xì)胞，血栓細(xì)胞，單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等組成。紅細(xì)胞承擔(dān)著魚體內(nèi)運輸氧氣和吞噬的功能。周永燦等[15]認(rèn)為，魚類紅血細(xì)胞的大小因種類和生活環(huán)境而有一定差異；林浩然[16]認(rèn)為，紅細(xì)胞大小與運動能力強(qiáng)弱有關(guān)；鄧時銘等[17]也認(rèn)為紅細(xì)胞的數(shù)量和大小影響魚類的運動水平。達(dá)氏鰉外周血細(xì)胞中紅細(xì)胞的體積要比鯉科魚類[18]小，數(shù)量也要少，因此，達(dá)氏鰉的運動能力要比鯉科魚類弱。

在眾多魚類外周血細(xì)胞研究中，甚至是同一種魚血細(xì)胞分類組成差異也極大。姚德冬等[4]認(rèn)為，中華鱘白細(xì)胞中血栓細(xì)胞數(shù)量最多，然而，張艷珍等[5]卻認(rèn)為白細(xì)胞中淋巴細(xì)胞數(shù)量最多。在達(dá)氏鰉白細(xì)胞中，觀察到以淋巴細(xì)胞數(shù)量居多，這也與點帶石斑魚（Epinephelus coioides）[19]、鱖（Siniperca chuatsi）[20]、歐洲鰻鱺（Anguilla anguilla）[21]、雜交石斑魚（Epinephelus fuscoguttatus♀×Epinephelus lanceolatus♂）[22]和卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）[23]等相同，而美國紅魚（Sciaenops ocellatus）[24]、淡水石斑（Cichlasoma managuense）[25]、軍曹魚（Rachycentron canadum）[26]和小點貓鯊（Scyliorhinus canicula）[27]等外周血細(xì)胞中以血栓細(xì)胞數(shù)量居多。魚類血栓細(xì)胞的數(shù)量次于淋巴細(xì)胞的白細(xì)胞[28]。達(dá)氏鰉外周血細(xì)胞以淋巴細(xì)胞數(shù)量居多，占白細(xì)胞總數(shù)的50%以上，原因可能是達(dá)氏鰉是大型溯河洄游魚類，習(xí)慣長距離洄游向產(chǎn)卵場，且喜歡棲息在水體中下層，在這過程中容易受傷，白細(xì)胞中的淋巴細(xì)胞能夠在達(dá)氏鰉受傷后快速凝血，并將入侵的病原殺死，形成免疫保護(hù)。

與中華鱘[4]、高首鱘[6]、雜交鱘[7]和施氏鱘[8]情況一致，達(dá)氏鰉的粒細(xì)胞有嗜中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞，未發(fā)現(xiàn)有嗜堿性粒細(xì)胞。這可能與制片過程中容易解體有關(guān)[29]，也可能是因為嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)量太少，觀察范圍受限，不能全面的進(jìn)行觀察。而林光華等[29]認(rèn)為，草魚（Ctenopharyngodon idellus）的嗜堿性粒細(xì)胞只在幼齡魚中出現(xiàn),在成魚中未觀察到?？梢?，嗜堿性粒細(xì)胞易水解可能是觀察不到的一個原因,也可能隨著魚類的生長而消失，因此，達(dá)氏鰉外周血細(xì)胞中是否有嗜堿性粒細(xì)胞尚未定論。

3.2 魚類血細(xì)胞的吞噬功能

目前，有關(guān)生物個體紅細(xì)胞免疫功能的研究很多很深入，其相關(guān)研究主要集中在豬等哺乳動物上，而有關(guān)于魚類紅細(xì)胞免疫功能的研究報道則較少。本研究發(fā)現(xiàn)，達(dá)氏鰉血細(xì)胞中紅細(xì)胞有明顯的吞噬酵母的現(xiàn)象，吞噬率達(dá)到了（22.84±3.21）%。血細(xì)胞的吞噬能力是魚類的一種重要免疫保護(hù)機(jī)制；在外周血細(xì)胞中紅細(xì)胞的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他血細(xì)胞，因此紅細(xì)胞在面對入侵的免疫復(fù)合物時會形成病原識別體以此保護(hù)自身的安全。粒細(xì)胞是魚體免疫細(xì)胞，能參與機(jī)體炎癥反應(yīng)殺滅病原菌，也可吞噬或吞飲細(xì)菌及寄生蟲幼蟲，起到免疫防御的功效[30]。本實驗中發(fā)現(xiàn)粒細(xì)胞和單核細(xì)胞也能黏附酵母也驗證了這一結(jié)論。

3.3 魚類血細(xì)胞的發(fā)生場所

Zapata 等的研究證實，硬骨魚類的頭腎通常被認(rèn)為是類似于哺乳動物的骨髓，具有造血功能，體腎是造血干細(xì)胞歸巢和分化的場所[31]，脾的造血功能通常僅限于紅細(xì)胞和血栓細(xì)胞的生成[33]。與美國紅魚[24]、長吻鮠（Leiocassis longirostris）[31]、日本黃姑魚（Argyrosomus japonicus）[35]和斑馬魚（Brachydanio rerio var）[36]研究結(jié)果一致，且根據(jù)各組織中未成熟的細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的比例（表2）為依據(jù)，達(dá)氏鰉紅細(xì)胞，粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的發(fā)生場所主要是頭腎和體腎，淋巴細(xì)胞的發(fā)生場所主要是脾臟。對于肝臟的造血功能結(jié)論也不同，原始血細(xì)胞并未在肝臟中發(fā)現(xiàn)，反而是成熟血細(xì)胞在肝臟中的比例比較高，因此認(rèn)為肝臟可能不是造血器官。但是，是否把肝臟作為造血器官還需要更多的探究。