吳再強(qiáng)，鄒慧斌 ，季更生，張汝兵，咸 漠

(1.江蘇科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212018;2.中科院青島生物能源與過程研究所，山東青島266101)

乳酸的構(gòu)型可以分為L－乳酸、D－乳酸和DL－乳酸［1］，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、輕紡、化工和環(huán)保等領(lǐng)域［2］。近年來，利用高品質(zhì)的L－乳酸聚合生產(chǎn)的生物可降解塑料及醫(yī)療活性材料正被迅速推廣應(yīng)用［3］，向世界展示了L－乳酸的巨大發(fā)展前景。由于我國在L－乳酸的質(zhì)量和產(chǎn)量上都不能滿足市場日益增長的需求，且產(chǎn)品多為消旋的 DL－乳酸，品質(zhì)較低［2］，因此對L－乳酸的工業(yè)發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化研究，對于提高我國 L－乳酸的產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要的意義［2－4］。秦浩等［2］以乳酸菌 G－02為出發(fā)菌株，采用 DES和NTG誘變處理，采用高溫高糖培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，最后獲得一株L－乳酸菌G－04，在搖瓶發(fā)酵條件下發(fā)酵液中可積累L－乳酸151g/L。高年發(fā)等［5］以野生型乳酸乳桿菌干酪亞種進(jìn)行發(fā)酵，乳酸產(chǎn)量最高為143.8g/L。但他們都沒有對L－乳酸進(jìn)行光學(xué)純度分析。Se－Kwon Moon［10］等篩選得到一株 Lactobacillus paracasei subs p.paracasei CHB2121，經(jīng)過發(fā)酵優(yōu)化后，L－乳酸的光學(xué)純度達(dá)到96.6%。本實(shí)驗(yàn)研究了一株干酪乳桿菌的種子培養(yǎng)方式、中和劑添加方式和培養(yǎng)基組等對L－乳酸產(chǎn)量和光學(xué)純度的影響，旨在為工業(yè)化生產(chǎn)L－乳酸發(fā)酵工藝的進(jìn)一步優(yōu)化提供一定的借鑒依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)ZW－63A 中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所生物基化學(xué)品團(tuán)隊(duì)篩選，選育與保藏;葡萄糖、乙酸鈉、碳酸鈣、吐溫－80等試劑 均是分析純，國藥集團(tuán);蛋白胨、酵母粉 OXOID公司;L－乳酸標(biāo)樣 山東省科學(xué)院。

Cary 50 UV－Vis型紫外分光光度計(jì) Varian公司;GSP－9080MBE型隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;6－16型臺式高速離心機(jī)Sigma公司;SW－CJ－1FD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;SBA－40D生物傳感分析儀 山東省科學(xué)院生物研究所;DHG9076A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;ZHWY－1102C雙層小容量恒溫?fù)u床 上海智誠公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵工藝最優(yōu)工藝參數(shù)的確定 在做單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)，依次改變葡萄糖、酵母粉、乙酸鈉和磷酸二氫鉀的添加量，同時(shí)改變種子培養(yǎng)方式、碳酸鈣添加方式以及改變裝液量，在單因素實(shí)驗(yàn)中，每個(gè)梯度都設(shè)置三個(gè)平行的搖瓶實(shí)驗(yàn)，取三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)的平均值作為測量結(jié)果，以L－乳酸產(chǎn)量和菌體OD值為評價(jià)指標(biāo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。通過前面的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，最后確定葡萄糖、酵母粉和乙酸鈉三個(gè)因素設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)［6－8］，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的水平和編碼見表1。

表1 Box－Behnken設(shè)計(jì)各因子及其編碼值Table 1 Each variable at different levels in Box－behnken design

1.2.2 響應(yīng)面模型的分析驗(yàn)證 將響應(yīng)面優(yōu)化后的最佳結(jié)果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證［6］，在最優(yōu)的發(fā)酵條件下，設(shè)置三個(gè)平行的搖瓶的實(shí)驗(yàn)，首先用 Design－Expert 8.0.7軟件將優(yōu)化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與響應(yīng)面模型進(jìn)行擬合，得到擬合二次多項(xiàng)式回歸方程，對該模型進(jìn)行回歸方程分析和方差分析，確定出其極值點(diǎn)以及取得極值相應(yīng)自變量的取值，按照模型優(yōu)化出來的最優(yōu)工藝參數(shù)進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證模型的可靠性，并確定最后的優(yōu)化結(jié)果［7－8］。

1.2.3 乳酸的分析方法 L－乳酸含量的測定時(shí)，先將發(fā)酵液混勻，移取100μL的發(fā)酵液稀釋到500倍，10000r/min離心1min，采用生物傳感分析儀測定，將三個(gè)平行的搖瓶實(shí)驗(yàn)測定后取其平均值;乳酸的光學(xué)純度用高效液相色譜法(手性分離柱)進(jìn)行測定，首先移取100μL混勻的發(fā)酵液稀釋至100倍，然后用0.22μm的濾膜過濾，乳酸光學(xué)純度測定條件:采用Sumichiral OA－5000 4.6mm×150mm手性分離柱，流動相為2mmol/L CuSO45%異丙醇，流速為1mL/min，柱溫 35℃，紫外檢測波長 236nm［10］。

1.2.4 菌體濃度的測定 先將發(fā)酵過后的發(fā)酵液室溫下靜置30min，移取發(fā)酵液中的上清液100μL稀釋至50倍，利用分光光度計(jì)在波長600nm處測定菌體的 OD 值［9－10］，將三個(gè)平行的搖瓶實(shí)驗(yàn)的樣品測定后取其平均值作為OD值的測定結(jié)果，發(fā)酵液中菌體的總OD值=OD600×稀釋倍數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)，取其平均值，平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差的統(tǒng)計(jì)分析由Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行處理。除響應(yīng)面分析外的繪圖由Origin 8.5軟件統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)完成。響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析采用統(tǒng)計(jì)分析軟件Design－Expert 8.0.7。

2 結(jié)果與分析

2.1 確定種子培養(yǎng)方式與接種時(shí)間

如圖1所示，種子的培養(yǎng)方式一定程度上會影響菌體濃度，本實(shí)驗(yàn)采取以下四種培養(yǎng)方式:靜置培養(yǎng);振蕩培養(yǎng);靜置12h再振蕩培養(yǎng);振蕩12h再靜置培養(yǎng)。由圖1可以看出，采取靜置12h再振蕩培養(yǎng)的菌體濃度最高，并且在培養(yǎng)到20h時(shí)菌體濃度達(dá)到最高，在16～20h菌體進(jìn)入對數(shù)生長期，20h之后菌體濃度變化不大，菌體已進(jìn)入穩(wěn)定期，為了減少菌體接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)的延遲期，同時(shí)為了保證接入發(fā)酵培養(yǎng)的種子的活力，防止菌種衰亡老化，選擇將種子培養(yǎng)到18、20、22h分別接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，結(jié)果如圖2所示。其中選擇將種子培養(yǎng)到20h時(shí)，乳酸產(chǎn)量最高，菌體濃度最低，葡萄糖消耗量最多，而培養(yǎng)到18h接種時(shí)，菌體濃度最高，乳酸產(chǎn)量最低，說明高密度發(fā)酵不利于乳酸的產(chǎn)生，因此，種子的培養(yǎng)方式采取先靜置再振蕩培養(yǎng)的方式(靜置12h+振蕩8h)最佳。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 不同碳源及其濃度對乳酸發(fā)酵的影響 碳源是產(chǎn)物乳酸的最終骨架結(jié)構(gòu)來源，由圖3所示，葡萄糖作為碳源時(shí)乳酸產(chǎn)量明顯高于蔗糖和麥芽糖的，蔗糖和麥芽糖對L－乳酸發(fā)酵影響相差不大，因此選擇葡萄糖作為乳酸發(fā)酵的最佳碳源。碳源濃度的大小也會對乳酸發(fā)酵產(chǎn)生影響，初始發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖濃度的大小一定程度上決定了乳酸的產(chǎn)量［11］，由圖4所示，當(dāng)裝液量為100mL，葡萄糖添加量為16g時(shí)，乳酸產(chǎn)量最高，大于16g時(shí)乳酸產(chǎn)量反而下降，可能是由于過高的葡萄糖濃度致使發(fā)酵液的滲透壓增大，使得菌體不能夠較好的生長繁殖和進(jìn)行正常的新陳代謝，從而導(dǎo)致最終菌體生長的濃度過低和乳酸產(chǎn)量過低。

圖3 不同碳源對L－乳酸發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of different carbon sources on L－lactic acid fermentation

圖4 初始葡萄糖添加量對L－乳酸發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of different glucose concentration on L－lactic acid fermentation

2.2.2 碳酸鈣添加方式對乳酸發(fā)酵的影響 由于在乳酸發(fā)酵過程中菌體不斷向外環(huán)境產(chǎn)生大量的L－乳酸，造成發(fā)酵液中酸性過大，能夠抑制后續(xù)乳酸的產(chǎn)生［12］，為了研究碳酸鈣的添加方式對乳酸發(fā)酵的影響，設(shè)計(jì)了四種不同碳酸鈣添加方式對乳酸發(fā)酵影響的實(shí)驗(yàn)，4種方式分別為:不加碳酸鈣;一次性添加10g碳酸鈣;首先添加5g碳酸鈣培養(yǎng)1d后再添加5g碳酸鈣;首先添加5g碳酸鈣培養(yǎng)2d后再添加5g碳酸鈣。結(jié)果如圖5所示，選擇發(fā)酵培養(yǎng)前一次性添加10g碳酸鈣，菌體濃度最高以及乳酸產(chǎn)量也是最高，而不加碳酸鈣時(shí)乳酸產(chǎn)量明顯低于添加碳酸鈣的乳酸產(chǎn)量，說明添加碳酸鈣對促進(jìn)乳酸產(chǎn)量的提高具有很大作用，因此選用過一次性添加10g碳酸鈣的添加方式不僅可以減少操作工序，還能夠提高發(fā)酵速度，在發(fā)酵過程中需要振蕩，以使碳酸鈣能夠充分中和乳酸［12］。

圖5 不同碳酸鈣添加方式對L－乳酸發(fā)酵的影響Fig.5 Effect of different calcium carbonate on L－lactic acid fermentation

2.2.3 不同裝液量對乳酸發(fā)酵的影響 由圖6可以看出，當(dāng)裝液量為100mL時(shí)，乳酸產(chǎn)量最高，可能是當(dāng)裝液量太少時(shí)，溶氧過多不利于厭氧發(fā)酵乳酸的產(chǎn)生，當(dāng)裝液量太多時(shí)由于底層的碳酸鈣粉末不能與產(chǎn)生的乳酸充分中和，從而使乳酸的積累對發(fā)酵生產(chǎn)乳酸起到了抑制作用。

圖6 不同裝液量對L－乳酸發(fā)酵的影響Fig.6 Effect of different liquid medium volume on L－lactic acid fermentation

2.2.4 不同氮源及其氮源濃度對乳酸發(fā)酵的影響［11－14］向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入不同的氮源，分別為蛋白胨、酵母粉、蛋白胨+酵母粉，三種不同的氮源，裝液量為100mL，當(dāng)?shù)醇尤肓肯嗤?7℃搖床厭氧發(fā)酵96h，通過圖7結(jié)果所示，酵母粉作為單一氮源時(shí)，乳酸產(chǎn)量反而高于蛋白胨+酵母粉的混合氮源，當(dāng)只加蛋白胨時(shí)乳酸產(chǎn)量明顯低于其它兩種方式，而且通過圖7可以看出蛋白胨作為氮源時(shí)菌體生長的OD值明顯低于其它兩種培養(yǎng)方式，可能是高濃度的氮抑制了菌的生長和乳酸的產(chǎn)生。由于只加酵母粉作為氮源乳酸產(chǎn)量和OD值都高于蛋白胨+酵母粉的添加方式，且只添加酵母粉還能夠解決經(jīng)濟(jì)成本，因此選用酵母粉作為氮源發(fā)酵生產(chǎn)L－乳酸最佳。

圖7 不同氮源對L－乳酸發(fā)酵的影響Fig.7 Effect of different nitrogen sources on L－lactic acid fermentation

確定酵母粉為最佳氮源后，對酵母粉添加量做進(jìn)一步優(yōu)化，裝液量為100mL，結(jié)果如圖8所示，當(dāng)酵母粉添加量為1、2g時(shí)乳酸產(chǎn)量最高，從節(jié)約經(jīng)濟(jì)成本上考慮，選擇添加量為1g較好，因此酵母粉添加量為1g。

圖8 不同酵母粉添加量對L－乳酸發(fā)酵的影響Fig.8 Effect of different yeast extract concentration on L－lactic acid fermentation

2.2.5 不同乙酸鈉添加量對乳酸發(fā)酵的影響 裝液量為100mL，接種量為10%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9所示。從圖9中可以看出，當(dāng)乙酸鈉添加量為0.2g時(shí)，乳酸的產(chǎn)量最高，當(dāng)乙酸鈉添加量超過0.4g時(shí)菌體濃度逐漸降低，說明可能是高濃度的乙酸鈉不利于菌體生長和L－乳酸的產(chǎn)生。

圖9 不同乙酸鈉添加量對L－乳酸發(fā)酵的影響Fig.9 Effect of different sodium acetate anhydrous concentration on L－lactic acid fermentation

2.2.6 磷酸二氫鉀添加量對乳酸發(fā)酵的影響 裝液量為100mL，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖10所示。當(dāng)磷酸二氫鉀添加量為0.1g時(shí)乳酸的產(chǎn)量最高，而菌體的濃度是隨著磷酸二氫鉀的添加量逐漸降低的，說明磷酸二氫鉀的加入是不利于干酪乳桿菌菌體的生長，但是添加0.1g是有利于乳酸產(chǎn)量的增加，可能是菌體代謝過程中一定的磷酸鹽有助于菌體進(jìn)行代謝產(chǎn)乳酸。

圖10 不同磷酸二氫鉀添加量對L－乳酸發(fā)酵的影響Fig.10 Effect of different KH2PO4concentration on L－lactic acid fermentation

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基的響應(yīng)面優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選定葡萄糖、酵母粉和乙酸鈉這三個(gè)對L－乳酸產(chǎn)量影響較大的變量進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化，各因素的中心點(diǎn)水平的值根據(jù)單因素優(yōu)化的最佳值來確定，采用B－B實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析，實(shí)驗(yàn)包括12個(gè)析因?qū)嶒?yàn)和3個(gè)中心實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用Design－Expert8.0.7.1對葡萄糖、酵母粉和乙酸鈉這三個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化。

表2 三因素三水平的B－B實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Designs and the results of Box－Behnken

二次回歸方程為:Y=146.67+5.00A+18.12B+1.88C+11.25AB+1.25AC－7.50BC－5.83A2－27.08B2－7.08C2，此方程為編碼值的方程，式中 A、B、C、分別為葡萄糖、酵母粉、乙酸鈉。該回歸方程的方差分析如表3，三個(gè)因素影響顯著性的順序?yàn)?酵母粉＞葡萄糖＞乙酸鈉。其中模型p=0.0023＜0.05，失擬項(xiàng)p=0.1318＞0.05，說明該模型回歸顯著，而失擬不顯著。另外該方程系數(shù)R2=0.9096，說明回歸方程的擬合程度較好，預(yù)測值與實(shí)測值之間具有較高的相關(guān)性，可以應(yīng)用于L－乳酸產(chǎn)量的理論預(yù)測。

表3 回歸模型方差分析Table 3 ANOVA of quadratic polynomial model

在獲得回歸非線性模型后，為求得三個(gè)因素的最佳值，根據(jù)所得到的回歸模擬方程分別對各變量求一階偏導(dǎo)數(shù)，并令其為0，得到一個(gè)三元一次方程組［15］，解此方程組可得到模型的極值(此值為各因素實(shí)際值):A(葡萄糖)=17.85g/100mL，B(酵母粉)=1.27g/100mL，C(乙酸鈉)=0.19g/100mL。即當(dāng)葡萄糖、酵母粉、乙酸鈉分別為 17.85、1.27、0.19g/100mL時(shí)，理論值L－乳酸產(chǎn)量為153.38g/L。

2.3.2 各因素之間的交互作用 葡萄糖、酵母粉、乙酸鈉這三個(gè)因素之間的兩個(gè)獨(dú)立變量之間的交互作用見圖11～圖13，當(dāng)研究兩個(gè)獨(dú)立變量之間交互作用時(shí)，此時(shí)的第3個(gè)變量的編碼值為0，第3個(gè)變量取中心點(diǎn)值［15］。

圖11 Y=f(A，B)的響應(yīng)面圖Fig.11 The response surface chart of Y=f(A，B)

圖12 Y=f(A，C)的響應(yīng)面圖Fig.12 The response surface chart of Y=f(A，C)

圖13 Y=f(B，C)的響應(yīng)面圖Fig.13 The response surface chart of Y=f(B，C)

2.3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)分析 根據(jù)上述優(yōu)化后，干酪乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基為(g/100mL):葡萄糖17.85，酵母粉1.27，乙酸鈉 0.19，磷酸二氫鉀 0.1，MgSO4·7H2O 0.02，MnSO4·H2O 0.005，吐溫－80 1mL，一次性添加CaCO310g/100mL。液體種子培養(yǎng)基先靜置培養(yǎng)12h再振蕩培養(yǎng)到20h接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵條件為:裝液量 100mL，接種量 10%，溫度 37℃，轉(zhuǎn)速150r/min，培養(yǎng)時(shí)間96h，在此條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，三個(gè)平行的搖瓶實(shí)驗(yàn)測得的 L－乳酸產(chǎn)量為:145、155、140g/L，平均值為146.67g/L，與理論預(yù)測值153.38g/L比較接近，是優(yōu)化前乳酸產(chǎn)量的2.03倍。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法能夠較好的模擬干酪乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L－乳酸的發(fā)酵條件，結(jié)果可靠。通過單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后，使得本實(shí)驗(yàn)室篩選得到的野生型干酪乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L－乳酸的產(chǎn)量達(dá)到146.67g/L，在搖瓶水平上L－乳酸產(chǎn)量略微高于目前相關(guān)文獻(xiàn)［5］報(bào)道的同類野生型干酪乳桿菌的最高L－乳酸產(chǎn)量143.8g/L，說明該菌株有較好的工業(yè)應(yīng)用前景。

經(jīng)過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化后，干酪乳桿菌在優(yōu)化后的最優(yōu)條件下進(jìn)行發(fā)酵96h后，乳酸的色譜圖如圖14所示，從圖中可以看出L－乳酸出峰時(shí)間為17.953min，D－乳酸的出峰時(shí)間為 23.738min，L－乳酸的色譜峰面積為11244.4，D－乳酸的色譜峰面積為443.379，經(jīng)計(jì)算得L－乳酸的光學(xué)純度為96.21%，比優(yōu)化前的光學(xué)純度提高了6.09%，同時(shí)優(yōu)化后的L－乳酸光學(xué)純度接近于相關(guān)文獻(xiàn)［10］報(bào)道的同類野生型干酪乳酸菌的高光學(xué)純度96.6%。

圖14 乳酸的光學(xué)純度分析色譜圖Fig.14 Chiral analysis of lactic acid

3 結(jié)論

采用單因素實(shí)驗(yàn)和Box－Behnken中心組合原理以及響應(yīng)面分析法對干酪乳桿菌ZW－63A發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，使L－乳酸產(chǎn)量有了較大幅度的提高，葡萄糖、酵母粉和乙酸鈉這三個(gè)因素對L－乳酸產(chǎn)量擬合出的回歸模型經(jīng)檢驗(yàn)證明該模型合理可靠，能較好的預(yù)測L－乳酸的產(chǎn)量，通過模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，得到的因素主效應(yīng)關(guān)系為:酵母粉＞葡萄糖＞乙酸鈉，由該模型確定的最佳條件為葡萄糖17.85g，酵母粉1.27g，乙酸鈉0.19g，在此條件下，得到的L－乳酸產(chǎn)量為146.67g/L，是優(yōu)化前的2.03倍。本實(shí)驗(yàn)的重要性和突破性在于，發(fā)現(xiàn)了種子培養(yǎng)方式、中和劑添加方式和培養(yǎng)基組成能夠影響L－乳酸的產(chǎn)量和光學(xué)純度，對實(shí)驗(yàn)室篩選得到的野生型干酪乳桿菌，通過單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后，在搖瓶水平上，L－乳酸的產(chǎn)量略微高于目前相關(guān)文獻(xiàn)［5］報(bào)道的同類野生型干酪乳桿菌的最高L－乳酸產(chǎn)量143.8g/L，同時(shí)優(yōu)化后的L－乳酸光學(xué)純度提高到96.21%，接近于相關(guān)文獻(xiàn)［10］報(bào)道的同類野生型干酪乳酸菌的L－乳酸高光學(xué)純度96.6%，說明該菌株有較好的工業(yè)應(yīng)用前景。

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