樂(lè)小炎，原 林，林少杰，陶葉杏，谷毅鵬，劉華忠

(1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524088;2.廣東海洋大學(xué)生物化學(xué)中心，廣東湛江524088)

烏賊墨已被證明是一種多功能生物活性物質(zhì)，其主要成分有黑色素、蛋白質(zhì)、多糖等。近年來(lái)，少量報(bào)道對(duì)SIP的構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行了較為深入的研究，發(fā)現(xiàn)其生物學(xué)功能具有廣譜性，如抗菌及保鮮作用［1］、抗氧化［2］、增強(qiáng)免疫力［3］等。在近年來(lái)我們報(bào)道 SIP的化療保護(hù)功能之后，最近發(fā)現(xiàn)SIP能有效緩解CP導(dǎo)致的小鼠睪丸損傷，提高精子的數(shù)量和質(zhì)量。上述生物學(xué)功能的發(fā)現(xiàn)是基于粗多糖的研究。有研究表明，硫酸葡聚糖在分子量為1ku時(shí)具有體外抗HIV活性，且活性隨著分子量的增加而增強(qiáng)，在10ku時(shí)達(dá)到最大［4］。因此，目前所報(bào)道的SIP功能的實(shí)現(xiàn)是某均一性多糖抑或協(xié)同作用的結(jié)果，仍不得而知，尚需進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分離純化某一分子量片段的SIP，探討其對(duì)睪丸化療性損傷的緩解作用，為進(jìn)一步探討不同分子量多糖對(duì)其生物活性功能的影響提供理論基礎(chǔ)，也為我國(guó)烏賊墨的開(kāi)發(fā)利用提供實(shí)際指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

曼氏烏賊墨囊 湛江東豐批發(fā)市場(chǎng)，保藏在－20℃冰柜中冷凍備用;昆明小白鼠 廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;木瓜蛋白酶 北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司;Dextran 系列標(biāo)準(zhǔn)品(T－10，10ku;T－20，20ku;T－40，40ku;T－70，70ku;T－110，110ku)Pharmacia Fine Chemicals公司;注射用環(huán)磷酰胺(CP)江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司;Sephdex G－100 GE Healthcare;乳酸脫氫酶(LDH)、γ－谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ－GT)試劑盒 南京建成生物工程研究所;其他試劑均為分析純。KDC－160HR高速冷凍離心機(jī) 科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司;FDU－1100真空冷凍干燥機(jī) 托普儀器有限公司;UV－2550紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津儀器有限公司;DHL－A電腦恒流泵 上海青浦滬西儀器廠;N－1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 托普儀器有限公司;JY92－Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;TENSOR27紅外光譜儀 德國(guó)布魯克光譜儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SIP的分離 取烏賊墨囊4℃解凍，剪取墨汁，加入等體積的 PBS(0.01mol·L－1，pH7.2)，超聲處理，浸泡 8h，8000r·min－1離心 50min 去除沉淀，重復(fù) 2次，再加入木瓜蛋白酶，50℃下水解90min，100℃滅酶失活10min，離心去除沉淀，然后加入四分之一體積的氯仿/正丁醇(體積比4∶1)，去除蛋白，重復(fù)3次，取上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，加入4倍體積的乙醇沉淀，冷凍干燥，得白色粉末樣品。采用Sephdex G－100作為填料，柱規(guī)格(1.0cm×100cm)分離純化，0.2%的NaCl溶液作為流動(dòng)相，流速為 0.5mL·min－1，每管收集2mL，蒽酮法檢測(cè)每管的含糖量，并合并同一峰下的樣品，冷凍干燥得到樣品。

1.2.2 純度鑒定和相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定 采用排阻高效液相色譜(SE－HPLC)分析，分別將不同分子量的葡聚糖標(biāo)品 T10、T20、T40、T70、T110 配制成 3mg·L－1，分別進(jìn)樣，記錄保留時(shí)間T。以T為橫坐標(biāo)，lgM為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程。取純化樣品溶解，配成3mg·L－1，記錄 T，推算其相對(duì)分子質(zhì)量。HPLC系統(tǒng)由島津 LC－20AT，RID－10A HPLC系統(tǒng)由島津LC－20AT，RID－10A示差檢測(cè)器組成(島津公司，日本)。色譜柱:Shodex Sugar KS－804(8 ×300mm);流動(dòng)相:0.1mol/L NaNO3溶液;流速 1mL/min;柱溫:常溫。

1.2.3 紫外光譜分析 將樣品用超純水配成1mg·L－1的水溶液，在 190～400nm 進(jìn)行光譜掃描。

1.2.4 紅外光譜分析 取樣品1mg，采用KBr壓片，在4000～400cm－1紅外波數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.2.5 硫酸根含量的測(cè)定 采用氯化鋇－明膠法［4］。

1.2.6 睪丸損傷的測(cè)定 選60只性成熟的雄性昆明小白鼠(28～30g)，隨機(jī)分成六組，空白組A，模型組B(腹腔注射 CP，15mg/kg，1 次/周，持續(xù) 10 周)，陰性對(duì)照組C(灌胃SIP，80mg/kg，1 次/d，持續(xù)10 周)，治療組 D、E、F(腹腔注射 CP，15mg/kg，1 次/周和灌胃 SIP，劑量分別是 65、80、95mg/kg，1 次/d，持續(xù) 10周)，正常的給水、喂食及飼養(yǎng)。10周后，頸椎處死小鼠，稱重，快速取出睪丸組織，預(yù)冷的生理鹽水清洗，吸干水分，稱重。用預(yù)冷的0.85%的NaCl溶液將睪丸組織勻漿成10%組織勻漿液，LDH及γ－GT的活力采用試劑盒檢測(cè)。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析。兩組間比較用t檢驗(yàn)，*p＜0.05，＊＊p＜0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外光譜分析

經(jīng)分離純化得到的SIP組分在波長(zhǎng)190～400nm處的光譜掃描圖譜如圖1。圖譜顯示，此多糖的特征吸收峰在190nm左右，在260及280nm未發(fā)現(xiàn)特征吸收峰，說(shuō)明該純化SIP不含有蛋白質(zhì)和核酸成分。

圖1 SIP的UVProbe紫外掃描儀上掃描圖譜Fig.1 Ultraviolet spectrum of SIP

2.2 純度及分子量的測(cè)定

SIP的HLPC圖譜(見(jiàn)圖2)顯示，SIP峰型較對(duì)稱，純度高。

根據(jù)已知葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)分子質(zhì)量(M)及保留時(shí)間(T)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖3)，得到回歸方程為T(mén)=－1.645lgM+15.95(R2=0.9999)，SIP的保留時(shí)間為8.434min，計(jì)算得SIP重均分子量為37068u。

圖2 SIP的HPLC圖譜Fig.2 HLPC profiles of SIP

圖3 葡聚糖分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Calibration curve for relative molecularweight determination

表1 SIP和CP對(duì)小鼠體重、睪丸重量及睪丸指數(shù)的影響Table 1 Effect of SIP and CP on body，testicular weights and testis index

2.3 紅外光譜分析

SIP的紅外圖譜(見(jiàn)圖4)顯示存在多糖的特征吸收峰，即在3398cm－1左右是O－H和N－H伸縮振動(dòng)的特征，2800cm－1左右是糖類(lèi) C－H 伸縮振動(dòng)，1423cm－1左右是C－H變角振動(dòng)。另外，在1648cm－1是由羧基C=O的伸縮振動(dòng)產(chǎn)生，在820cm－1為C－O－S伸縮振動(dòng)，1235cm－1是S=O的伸縮振動(dòng)，比較弱，說(shuō)明存在硫酸根基團(tuán)，含量測(cè)定證實(shí)存在3%硫酸根。

圖4 SIP的紅外圖譜Fig.4 Infrared absorption spectrum of SIP

2.4 小鼠體重、睪丸重量及睪丸指數(shù)的變化

從表1數(shù)據(jù)顯示，SIP能緩解CP導(dǎo)致的小鼠體重、睪丸重量(p＜0.05，p＜0.01)、睪丸指數(shù)(與模型組、空白組無(wú)顯著性差異)的降低，不同治療組間緩解效果不顯著(p＞0.05)。模型組與對(duì)照組相比，CP導(dǎo)致小鼠體重、睪丸重量、睪丸指數(shù)分別下降了15.12%(p＜0.01)、25%(p＜0.01)、12.48%(p＜0.05)。除治療組D外，其他治療組的小鼠體重、睪丸重量得到明顯(p＜0.01)的改善，且小鼠體重與空白組無(wú)顯著(p＞0.05)差異。

2.5 睪丸標(biāo)志性酶變化

圖5顯示，睪丸中γ－GT活力因SIP的治療得到明顯(p＜0.01)的改善。與空白組相比，CP導(dǎo)致γ－GT活力提高了1.71倍。與模型組相比，治療組降低了因CP導(dǎo)致γ－GT活力的增加，降低指數(shù)達(dá)35%左右，且各治療組間無(wú)顯著(p＞0.05)差異，同時(shí)與空白組無(wú)差異。

圖6顯示，SIP能緩解CP導(dǎo)致的LDH活力下降。CP明顯(p＜0.01)降低LDH的活力，除治療組D外，SIP治療組LDH活力得到顯著(p＜0.05)改善，與空白組無(wú)顯著(p＞0.05)差異。

圖5 睪丸中γ－GT活力Fig.5 Activity of γ－GT in testis

圖6 睪丸中LDH活力Fig.6 Activity of LDH in testis

3 結(jié)論與討論

眾所周知，多糖活性功能與結(jié)構(gòu)，包括分子量的大小、所含的官能團(tuán)等是密切相關(guān)的。近年來(lái)，關(guān)于SIP的結(jié)構(gòu)與功能有一系列研究，其結(jié)構(gòu)證實(shí)［5］由等摩爾質(zhì)量的三種單糖組成的重復(fù)單元，三種單糖分別是 N－乙酰半乳糖、巖藻糖、葡糖醛酸，結(jié)構(gòu)式［－3－GlcAβ－1，4－(GalNacα－1，3－)Fucα1－］n，與本研究紅外掃描圖譜相符合。

SIP具有多種生物活性功能，本研究結(jié)果表明SIP能緩解CP導(dǎo)致的睪丸損傷，確證了我們先前的結(jié)論［6］。CP導(dǎo)致睪丸重量的減輕與精子形成過(guò)程及睪丸組織損傷有關(guān)［7］。LDH位于成熟或正在成熟睪丸生精細(xì)胞線粒體膜內(nèi)，在質(zhì)子轉(zhuǎn)移的過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用。CP降低LDH酶活力，影響精子的發(fā)生及成熟［8］。γ－GT活性與睪丸支持細(xì)胞的成熟與增殖有關(guān)，其活性的升高是由于睪丸組織受到損傷［9］。SIP對(duì)CP導(dǎo)致的LDH活力的降低、γ－GT活性升高有緩解作用，這可能與SIP分子量及所含硫酸根有關(guān)。本研究測(cè)得分離純化SIP的重均分子量為37ku左右，硫酸根含量為3%，具有對(duì)睪丸損傷的保護(hù)作用。其保護(hù)作用效果及相關(guān)機(jī)制與分子大小及組成是否有關(guān)有待進(jìn)一步研究。

［1］吳金龍，羅劍秋，劉華忠，等.烏賊墨多糖對(duì)冷藏魷魚(yú)的防腐保鮮作用研究［J］.食品科學(xué)，2010，31(10):304－307.

［2］閔詩(shī)剛，王光，鐘杰平，等.烏賊墨多糖對(duì)大鼠外周血及血液中抗氧化能力影響［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2011，32(1):123－125.

［3］陸通，高春義，朱有名，等.烏賊墨升白作用的研究［J］.實(shí)用中西醫(yī)結(jié)合雜志，1995，8(3):163.

［4］王長(zhǎng)云，管華詩(shī).多糖抗病毒研究進(jìn)展Ⅱ:硫酸多糖抗病毒作用［J］.生物工程進(jìn)展，2000，20:3－8.

［5］Takaya Y，Uchisawa H，Narumi F，et al.Illexins A、B、and C from Squid Ink Should Have a Branched Structure［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，1996，226:335－338.

［6］樂(lè)小炎，許澤旋，師麗莎，等.烏賊墨多糖對(duì)環(huán)磷酰胺損傷小鼠生精功能的影響［J］.中國(guó)海洋藥物，2012，31(5):23－26.

［7］Katoh C，Kitajima S，Saga Y，Kanno J，et al.Assessment of quantitative dual－parameter flow cytometric analysis for the evaluation of testicular toxicity using cyclophosphamide－and ethinylestradiol－ treated rats［J］.The Journal of Toxicological Sciences，2002，27(2):87－96.

［8］Selvakumar E，Prahalathan C，Mythili Y，et al.Beneficial effects of dl－a－lipoic acid on cyclophosphamide－induced oxidative stress in mitochondrial fractions of rat testis［J］.Chem Biol Intract，2005，152(1):59－66.

［9］Hodgen GD，Sherins RJ.Enzymes as markers of testicular growth and development in the rat［J］.Endocrinology，1973，93(4):985－989.