孫兆云，宋吉英，單 虎，呂海濤，*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院，山東青島266109;2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島266109)

牛蒡子(Fructus Arctii)為菊科二年生草本植物牛蒡(Arctium lappa L.)的干燥成熟果實(shí)。又名大力子、鼠粘子、惡實(shí)等。分布于東北、西北、中南、西南及臺(tái)灣的臺(tái)南等地。味辛、苦、性寒，歸肺、胃經(jīng)。牛蒡子的主要有效生物活性成分為牛蒡子苷和牛蒡子苷元［1］，不僅具有疏散風(fēng)熱、宣肺透疹、消腫解毒［2］、抗癌［3］、抗病毒［4］、降血糖［5－6］等作用，而且具有神經(jīng)保護(hù)［7］、抑制血小板、抗衰老［8］以及抗炎［9－10］等生理活性作用。目前，提取牛蒡子苷和牛蒡子苷元的主要方法包括傳統(tǒng)提取方法［11］、超臨界萃取法［12］、超聲輔助提取法［13］、微波輔助提取法［14］以及矩陣固相分散法提?。?5］。但利用微波法同時(shí)提取優(yōu)化牛蒡子中牛蒡子苷和牛蒡子苷元的工藝研究尚未見(jiàn)報(bào)道。與常規(guī)提取方法相比，微波提取具有選擇性高、快速高效、溶劑消耗少、活性成分提取率較高、適合于熱不穩(wěn)定物質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)。本文利用微波輔助提取法對(duì)牛蒡子中牛蒡子苷和牛蒡子苷元的同時(shí)提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化研究，為深入開(kāi)發(fā)和利用牛蒡子提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛蒡子樣品 購(gòu)于山東省青島市城陽(yáng)區(qū)當(dāng)?shù)厮幍?，已干燥至恒?牛蒡子苷和牛蒡子苷元標(biāo)準(zhǔn)品 上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司(純度≥98%);無(wú)水乙醇、甲醇等 色譜純;水 超純水。

Aglient 1100高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫科技有限公司;FW－100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司;SHB－III循環(huán)水式真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;DZX－1型真空干燥箱 上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;CASCADA超純水系統(tǒng) Pall公司;AR2140電子分析天平 上海奧斯豪國(guó)際工貿(mào)公司;RE－52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;TDL－50B微波合成萃取儀 北京祥鵠科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件選擇 用紫外分光光度計(jì)在200～400nm波長(zhǎng)范圍掃描得到牛蒡子苷和牛蒡子苷元的紫外吸收光譜圖，得到牛蒡子苷和牛蒡子苷元的最大吸收波長(zhǎng)均為286nm，確定檢測(cè)波長(zhǎng)286nm。

采用Agilent Eclipse XDB－C18色譜柱(4.6mm×150mm，5μm)，確定流動(dòng)相組成為甲醇∶水 =40∶60(v/v)，流速為 1.0mL/min，柱溫為 35℃，進(jìn)樣量20μL，牛蒡子苷和牛蒡子苷元的吸收峰可以有效地與雜質(zhì)吸收峰分離(圖1)。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密稱(chēng)取干燥至衡重的牛蒡子苷標(biāo)準(zhǔn)品28.0mg和牛蒡子苷元標(biāo)準(zhǔn)品3.0mg，用40%甲醇定容于25mL的容量瓶中，牛蒡子苷溶液的濃度為1.12mg/mL，牛蒡子苷元溶液的濃度為0.12mg/mL。

精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)品母液0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50mL，分別置于 5mL 容量瓶中，用40%甲醇定容，搖勻，配成一系列梯度質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后，利用高效液相色譜儀進(jìn)行分離測(cè)定。

1.2.3 樣品溶液的制備和牛蒡子苷、牛蒡子苷元含量的測(cè)定 將干燥至衡重的牛蒡子用萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎，過(guò) 60目篩。精密稱(chēng)取 1.0g牛蒡子粉，置于100mL圓底燒瓶中，加入適量乙醇后進(jìn)行微波提取，提取液冷卻后抽濾，用乙醇分次洗滌燒瓶及濾器，合并提取液和洗滌液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，濃縮物用40%甲醇溶解，移入50mL容量瓶中定容，搖勻，即得牛蒡子提取液樣品。用高效液相色譜進(jìn)樣分離測(cè)定，用外標(biāo)法進(jìn)行定量計(jì)算。

1.3 微波輔助提取牛蒡子苷和牛蒡子苷元工藝優(yōu)化

1.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.1.1 乙醇濃度的影響 精確稱(chēng)取牛蒡子粉末1.0g于100mL三口瓶中，微波功率400W，提取溫度為回流溫度，時(shí)間為150s，提取劑用量為30mL。提取劑分別為:蒸餾水，20%、40%、60%、80%乙醇，無(wú)水乙醇。用高效液相色譜法測(cè)出樣品中牛蒡子苷和牛蒡子苷元的得率。

1.3.1.2 溫度的影響 精確稱(chēng)取牛蒡子粉末1.0g于100mL三口瓶中，微波功率400W，提取劑為80%的乙醇 30mL，時(shí)間為 150s，提取溫度為:30、40、50、60、70℃、回流。用高效液相色譜法測(cè)出樣品中牛蒡子苷和牛蒡子苷元的得率。

1.3.1.3 微波功率的影響 精確稱(chēng)取牛蒡子粉末1.0g于 100mL三口瓶中，提取劑為80%的乙醇30mL，時(shí)間為150s，提取溫度為回流溫度，微波功率為 300、400、500、600、700、800、900、1000W。用高效液相色譜法測(cè)出樣品中牛蒡子苷和牛蒡子苷元的得率。

1.3.1.4 提取時(shí)間的影響 精確稱(chēng)取牛蒡子粉末1.0g于100mL三口瓶中，提取劑為 80%的乙醇30mL，提取溫度為回流溫度，微波功率為400W，提取時(shí)間分別為30、60、90、120、150、250、350、500s。用高效液相色譜法測(cè)出樣品中牛蒡子苷和牛蒡子苷元的得率。

1.3.1.5 料液比的影響 精確稱(chēng)取牛蒡子粉末1.0g于100mL三口瓶中，提取劑為80%的乙醇，提取溫度為回流溫度，微波功率為400W，提取時(shí)間為90s，加入乙醇的量分別為 4、8、10、20、30、40、50mL。用高效液相色譜法測(cè)出樣品中牛蒡子苷和牛蒡子苷元的得率。

1.3.2 正交實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取乙醇濃度(A)、微波功率(B)、料液比(C)、提取時(shí)間(D)、提取次數(shù)(E)作為考察因素，以樣品中牛蒡子苷和牛蒡子苷元的總得率為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)五因素四水平的正交實(shí)驗(yàn)(表1)。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels of total flavonoids

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以質(zhì)量濃度(c，mg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)，得到牛蒡子苷和牛蒡子苷元的回歸方程分別為:A=9097.2c－136.64，R2=0.9990;A=38580c－89.571，R2=0.9986。牛蒡子苷和牛蒡子苷元的檢出限分別為1.1μg/L和0.6μg/L。

利用HPLC對(duì)牛蒡子中牛蒡子苷和牛蒡子苷元的分離測(cè)定色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇濃度對(duì)牛蒡子苷和牛蒡子苷元得率的影響 從圖2可以看出，在實(shí)驗(yàn)條件下，牛蒡子苷得率與牛蒡子苷和牛蒡子苷元的總得率具有相同的變化趨勢(shì)，均隨乙醇濃度的增大而增大，在80%處達(dá)到最大值。在40%到80%之間，二者總體趨于穩(wěn)定，變化幅度較小;對(duì)于牛蒡子苷元得率，隨著乙醇濃度的增加，其值逐漸降低。由于在牛蒡子中，牛蒡子苷的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于牛蒡子苷元，故在本實(shí)驗(yàn)選取適宜條件時(shí)，以牛蒡子苷和牛蒡子苷元的總得率為考察指標(biāo)。

2.2.2 溫度對(duì)牛蒡子苷和牛蒡子苷元得率的影響 從圖3可以看出，在實(shí)驗(yàn)條件下，牛蒡子苷得率、牛蒡子苷元得率與牛蒡子苷和牛蒡子苷元的總得率基本具有相同的變化趨勢(shì)，均隨溫度的增大而增大，當(dāng)溫度在40～70℃之間時(shí)，三者趨于平穩(wěn);溫度達(dá)到反應(yīng)溶液的沸點(diǎn)時(shí)，三者的值均達(dá)到最大。本實(shí)驗(yàn)不再考察溫度的影響，在回流條件下進(jìn)行提取。

圖1 牛蒡子苷和牛蒡子苷元的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatogram of arctiin and arctigenin

圖2 乙醇濃度對(duì)樣品中牛蒡子苷和牛蒡子苷元得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the yields of arctiin and arctigenin

圖3 溫度對(duì)樣品中牛蒡子苷和牛蒡子苷元得率的影響Fig.3 Effect of temperature on the yields of arctiin and arctigenin

2.2.3 微波功率對(duì)牛蒡子苷和牛蒡子苷元得率的影響 從圖4可以看出，在實(shí)驗(yàn)條件下，牛蒡子苷得率與牛蒡子苷和牛蒡子苷元的總得率具有相同的變化趨勢(shì)，其值均在功率為400W時(shí)達(dá)到最大值。牛蒡子苷元得率則在功率為800W時(shí)達(dá)到最大值。

圖4 微波功率對(duì)樣品中牛蒡子苷和牛蒡子苷元得率的影響Fig.4 Effect of microwave power on the yields of arctiin and arctigenin

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)牛蒡子苷和牛蒡子苷元得率的影響 從圖5可以看出，在實(shí)驗(yàn)條件下，牛蒡子苷得率與牛蒡子苷和牛蒡子苷元的總得率具有相同的變化趨勢(shì)，其值均隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)而增大，在提取時(shí)間為90s時(shí)達(dá)到最大值。之后牛蒡子苷得率和總得率總體均有所降低，牛蒡子苷元得率則在90s后趨于穩(wěn)定。

圖5 提取時(shí)間對(duì)牛蒡子苷和牛蒡子苷元得率的影響Fig.5 Effect of extraction time on the yields of arctiin and arctigenin

2.2.5 料液比對(duì)牛蒡子苷和牛蒡子苷元得率的影響 從圖6可以看出，在實(shí)驗(yàn)條件下，牛蒡子苷得率與牛蒡子苷和牛蒡子苷元的總得率具有相同的變化趨勢(shì)，其值均隨著料液比的增加而增大，在料液比為1∶20時(shí)達(dá)到最大值，之后牛蒡子苷得率和總得率總體均逐漸降低;牛蒡子苷元得率隨料液比的增加總體呈上升趨勢(shì)，也在料液比為1∶20處達(dá)到最大值。

圖6 料液比對(duì)樣品中牛蒡子苷和牛蒡子苷元得率的影響Fig.6 Effect of ratio of material to liquid on the yields of arctiin and arctigenin

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test results

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2正交實(shí)驗(yàn)直觀分析可知，各因素對(duì)牛蒡子苷和牛蒡子苷元總得率的影響順序?yàn)?B＞A＞D＞C＞E。由表3方差分析可得，從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度看，五個(gè)因素中A因素和B因素為顯著因素，其余三個(gè)因素均為不顯著性因素。由于在因素C1、C2和C4條件下牛蒡子苷和牛蒡子苷元的平均總得率相差甚微，本著節(jié)約時(shí)間的選取原則，最后確定以B2A2C1D2E3為最佳提取條件，即乙醇濃度40%，提取3次，料液比1∶15(g/mL)，提取功率500W，提取時(shí)間200s。

2.3.1 最佳工藝條件驗(yàn)證 取1g牛蒡子粉末，在最佳提取工藝條件下提取，重復(fù)5次，被測(cè)樣品中牛蒡子苷的平均得率為7.14%，RSD=0.49%;牛蒡子苷元的平均得率為0.53%，RSD=1.06%;平均總得率為7.67%，RSD=0.52%。高于正交設(shè)計(jì)表中的最大值，表明所選取提取工藝穩(wěn)定、可靠。

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis

2.3.2 最佳工藝放大實(shí)驗(yàn) 取10g牛蒡子粉末，在最佳提取工藝條件下提取，牛蒡子苷和牛蒡子苷元的得率分別為6.84%和0.54%，總得率為7.38%，略低于放大前實(shí)驗(yàn)，表明上述提取工藝條件為牛蒡子苷和牛蒡子苷元的最佳提取工藝條件。

2.3.3 精密度實(shí)驗(yàn) 將在最佳提取工藝條件下制備的樣品提取液按含量測(cè)定方法，連續(xù)進(jìn)樣5次，牛蒡子苷的平均得率為7.13%，RSD為0.54%;牛蒡子苷元的平均得率為0.53%，RSD為1.59%;牛蒡子苷和牛蒡子苷元的平均總得率為7.66%，RSD為0.59%。結(jié)果表明，測(cè)定方法具有良好的精密度。

2.3.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 在最佳提取工藝條件下的提取樣品中，加入標(biāo)準(zhǔn)品，用同樣的檢測(cè)方法測(cè)出加樣后樣品中牛蒡子苷和牛蒡子苷元的含量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表4，表明檢測(cè)方法準(zhǔn)確、可靠。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以乙醇為提取溶劑，探究了牛蒡子中牛蒡子苷和牛蒡子苷元的微波輔助提取工藝，并對(duì)提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。由于在牛蒡子中，牛蒡子苷的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于牛蒡子苷元，在選取適宜實(shí)驗(yàn)條件時(shí)，以牛蒡子苷和牛蒡子苷元的總得率為考察指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)研究所得最佳微波提取工藝條件為:乙醇濃度40%，料液比 1∶15(g/mL)，提取功率 500W，提取時(shí)間200s，提取3次，牛蒡子苷和牛蒡子苷元得率分別為7.14%和0.53%，精密度分別為0.49%和1.06%。將所選取的最佳工藝放大10倍實(shí)驗(yàn)，得到牛蒡子苷和牛蒡子苷元的得率分別為6.84%和0.54%。放大前后牛蒡子苷和牛蒡子苷元得率非常接近，表明此工藝條件合理、可靠、穩(wěn)定性好。

表4 加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果Table 4 Result of standard addition recovery

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