宋年華，李 丹，徐 巖

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 青島 266003)

腎臟是發(fā)生缺血再灌注損傷(IR)極為常見的器官之一，腎移植、嚴(yán)重創(chuàng)傷、休克后延遲復(fù)蘇會(huì)導(dǎo)致不同程度的腎臟IR，甚至可導(dǎo)致急性腎損傷和移植腎功能喪失［1］。c-jun氨基末端激酶(JNK)信號(hào)通路作為絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)超家族成員之一，在腎臟IR中發(fā)揮重要的調(diào)控作用［2］。JNK及其下游轉(zhuǎn)錄因子ATF-2在腎臟IR中的表達(dá)尚不清楚。2011年12月～2012年7月，我們觀察了腎臟IR大鼠腎小管上皮細(xì)胞JNK/ATF-2信號(hào)通路的表達(dá)變化，探討其在腎臟IR發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:Wistar大鼠60只，體質(zhì)量200～250 g，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室溫度22～26℃，相對(duì)濕度40% ～60%，24 h晝夜燈光照射管制，清潔級(jí)顆粒飼料喂養(yǎng)，自來水飲用。主要試劑 :JNK、ATF-2磷酸化抗體(Santa Cruz公司)，免疫組化試劑盒(青島沃爾科生物技術(shù)公司)，RT-PCR試劑盒(南京凱基公司)，PCR 引物(上海生工)，DMSO(Sigma公司)。實(shí)驗(yàn)儀器:顯微鏡(日本奧林巴斯)、切片機(jī)(德國(guó)萊卡RM2015)、離心機(jī)(北京LDZ5-2)、電子天平(瑞士METTER AE100)、移液器(德國(guó) EPPENDORF)、干燥箱(日本三洋MDF-382E)、低溫冰箱(日本三洋MIR-153)、恒溫水浴箱(江蘇DSHZ-300)、醫(yī)用微波爐(浙江 YWY781B)、電泳儀(北京 DYY-12)、PCR儀(基因公司PE9600型)、制冰機(jī)(上海LQP-B-4)、純水系統(tǒng)(Millipore公司Biocel)、核酸蛋白分析儀(貝克曼公司DU650)臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(貝克曼64R)、凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)伯樂GEL DOC2000)。

1.2 模型制備 將60只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(對(duì)照組)和缺血再灌注組(IR組)。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，術(shù)前自由飲食，IR組參照文獻(xiàn)［3］，采用夾閉雙側(cè)腎動(dòng)、靜脈45 min后去夾再灌注制備IR模型。

1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察 兩組分別于再灌注0、10、30 min及1、24 h各處死大鼠6只，取腎組織4℃預(yù)冷生理鹽水沖洗，矢狀切取一半腎組織(兼顧腎皮髓質(zhì))4%甲醛固定，做免疫組化檢測(cè);另一半分裝置于凍存管于液氮轉(zhuǎn)－80℃保存，留作PCR檢測(cè)。

1.3.1 腎小管上皮細(xì)胞JNK、ATF-2表達(dá) ①磷酸化JNK、ATF-2蛋白表達(dá):采用免疫組化SP法，一抗稀釋度均為1∶100，PBS取代一抗作陰性對(duì)照。所有切片均在同一放大倍數(shù)下，每例隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，觀察腎小管上皮細(xì)胞JNK、ATF-2蛋白表達(dá)情況。結(jié)果經(jīng)Image-Pro Plus分析軟件處理，采用免疫組化評(píng)分(HIS)進(jìn)行半定量分析［4］，根據(jù)每張切片的陽性細(xì)胞面積及陽性細(xì)胞顯色強(qiáng)度進(jìn)行分級(jí)評(píng)分，HIS結(jié)果以兩項(xiàng)乘積表示。②JNK、ATF-2 mRNA表達(dá):采用RT-PCR法。Trizol法提取腎組織總RNA進(jìn)行半定量RT-PCR反應(yīng)。引物序列:β-actin 上游 5'-ACCACAGCTGAGAGGGAAATCG-3'，下游5'-AGAGGACCTTACGGATGTCAACG-3';JNK上游 5'-ACAGTGAGCAGAGCAGGCATAGTG-3'下游5'-TCCTCCCCAAACAAAATAGAAACCA-3';ATF-2上游 5'-ACGGCAGTGGATTGGTAG-3'，下游 5'-CTTCTTCTGCATGGCGGTTAC-3'。反應(yīng)條件:預(yù)變性:95 ℃、5 min，1 個(gè)循環(huán);PCR 反應(yīng):98 ℃、10 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，40個(gè)循環(huán);72 ℃ 終延伸 10 min。PCR產(chǎn)物定量:產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化已錠染色，凝膠成像系統(tǒng)掃描 DNA條帶，并應(yīng)用Quantity One4.6軟件分析灰度值。目的基因相對(duì)表達(dá)量以目的基因/β-actin的灰度值表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)均以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 磷酸化JNK、ATF-2蛋白表達(dá) 磷酸化JNK蛋白陽性反應(yīng)主要定位于腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)，磷酸化ATF-2陽性反應(yīng)主要定位于腎小管上皮細(xì)胞胞核，均呈棕黃色顆粒。對(duì)照組磷酸化JNK、ATF-2蛋白未見表達(dá)或較低表達(dá);IR組表達(dá)明顯上調(diào)，與Sham 組比較，P 均 ＜0.05，見表1。

表1 兩組再灌注不同時(shí)間點(diǎn)JNK、ATF-2蛋白表達(dá)(n=6，分，)

表1 兩組再灌注不同時(shí)間點(diǎn)JNK、ATF-2蛋白表達(dá)(n=6，分，)

注:與對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)比較，*P＜0.05;與本組不同時(shí)間點(diǎn)比較，△P ＜0.05

組別 JNK蛋白 ATF-2蛋白IR 組0 min 2.00 ±1.265* 1.83 ±1.329*10 min 4.67 ±1.033* 3.67 ±1.506*30 min 6.50 ±1.225＊△ 6.17 ±1.602＊△1 h 4.00 ±1.264* 3.50 ±1.761*24 h 3.67 ±1.506* 2.83 ±1.329*對(duì)照組0 min 0.33 ±0.516 0.33 ±0.51610 min 0.50 ±0.548 0.67 ±0.51630 min 0.50 ±0.837 1.00 ±0.6321 h 0.83 ±0.753 0.83 ±0.40824 h 0.67 ±0.516 0.83 ±0.753

2.2 JNK、ATF-2 mRNA表達(dá) RT-PCR結(jié)果顯示，IR組JNK、ATF-2 mRNA表達(dá)在早期即有增加，再灌注30 min出現(xiàn)高峰，再灌注1 h表達(dá)略減弱，24 h仍有高表達(dá);與假手術(shù)組比較，P均＜0.05。見表2。

表2 兩組再灌注不同時(shí)間點(diǎn)JNK、ATF-2 mRNA表達(dá)(n=6，灰度值，)

表2 兩組再灌注不同時(shí)間點(diǎn)JNK、ATF-2 mRNA表達(dá)(n=6，灰度值，)

注:與對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)比較，*P＜0.05;與本組不同時(shí)間點(diǎn)比較，△P ＜0.05

組別JNK mRNA ATF-2 mRNA IR 組0 min 0.83 ±0.123* 0.67 ±0.104*10 min 1.58 ±0.259* 1.50 ±0.189*30 min 2.35 ±0.239＊△ 2.23 ±1.194＊△1 h 1.52 ±0.210* 1.38 ±0.174*24 h 1.39 ±0.220* 1.27 ±0.126*對(duì)照組0 min 0.22 ±0.056 0.19 ±0.07510 min 0.25 ±0.080 0.22 ±0.08130 min 0.23 ±0.094 0.20 ±0.0691 h 0.24 ±0.077 0.21 ±0.06724 h 0.21 ±0.068 0.21 ±0.072

3 討論

腎臟是高灌注器官，對(duì)缺血及缺血再灌注均較敏感，腎IR是自體腎發(fā)生急性腎衰竭的主要原因。JNK信號(hào)通路是MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的一條重要通路，IR時(shí)其轉(zhuǎn)錄在很短時(shí)間內(nèi)(通常為數(shù)分鐘)被激活，其活化后可調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育及凋亡等［5］。ATF-2 又名 m-XBP、CRE-BP1，其作為真核基因特定的轉(zhuǎn)錄因子，編碼于染色體2q32，隸屬于ATF/cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)轉(zhuǎn)錄因子家族，ATF/CREB轉(zhuǎn)錄因子家族包含一段高度保守的5'-TGACGTCA-3'堿基回文結(jié)構(gòu)，稱為cAMP效應(yīng)元件(CRE)［6］。ATF-2是JNK的底物，上游激酶JNK將其磷酸化后成為活性形式而啟動(dòng)下游基因轉(zhuǎn)錄，ATF-2包含3個(gè)磷酸化位點(diǎn)，即 Thr69、Thr71和Ser90，但Ser90不直接參與轉(zhuǎn)錄。磷酸化的ATF-2通過與堿性亮氨酸拉鏈(b-ZIP)、CRE或激活蛋白-1(AP-1)家族如c-jun、c-fos元件組成異源二聚體的形式發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過程，調(diào)控基因表達(dá)［7，8］，其基因的活化產(chǎn)物參與了細(xì)胞凋亡，進(jìn)而損傷腎臟組織的結(jié)構(gòu)和功能。

本研究結(jié)果顯示，在腎IR早期，腎組織JNK、ATF-2磷酸化蛋白及mRNA的表達(dá)水平均顯著增加，于再灌注30 min出現(xiàn)高峰，再灌注1 h表達(dá)略減弱，24 h仍有高表達(dá)，提示磷酸化JNK通過激活下游信號(hào)分子ATF-2參與了腎IR的信號(hào)調(diào)控。因此可通過抑制腎缺血再灌注引起的JNK活化，影響細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)，進(jìn)而減少腎小管上皮細(xì)胞凋亡，減輕腎臟損傷。

目前IR誘發(fā)細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究已取得較大進(jìn)展，但仍有許多細(xì)節(jié)尚不清晰。對(duì)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路深入研究并明確其機(jī)制，可使阻斷細(xì)胞的死亡通路成為可能，通過干預(yù)改變?nèi)毖該p傷的程度，對(duì)急性腎損傷和移植腎功能喪失的防治將有重大的推動(dòng)作用。

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