陳 軍，覃思繁，林思彤，韋常宏

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，南寧 530021)

目前，胃癌的發(fā)生機(jī)制尚未闡明，其侵襲和轉(zhuǎn)移的分子調(diào)控機(jī)制研究是分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。其中，F(xiàn)as介導(dǎo)的凋亡抑制在乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程中有重要的作用。細(xì)胞型Fas相關(guān)的死亡區(qū)域蛋白樣白介素-1轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白(c-FLIP)被認(rèn)為是一種重要的細(xì)胞凋亡抑制蛋白。細(xì)胞核因子kappa B(NF-κB)是一種廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子，在多種腫瘤組織內(nèi)呈活化狀態(tài)，在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要的作用。近年來(lái)，我們采用免疫組化法檢測(cè)胃癌組織中的c-FLIP和NF-κB p65，觀察其表達(dá)變化，旨在探討兩者在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2004年1月～2006年6月本院收治的胃癌患者80例，男48例，女32例;年齡25～68(40.1±13.2)歲。患者術(shù)前均未行任何治療。手術(shù)留取胃癌組織標(biāo)本80份(胃癌組)，所有標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)。臨床分期Ⅰ、Ⅱ期36例，Ⅲ期44例;腫瘤直徑≥3 cm 52例，＜3 cm 28例;浸潤(rùn)至黏膜及肌層44例，漿膜及漿膜外36例;組織學(xué)類(lèi)型為管狀腺癌34例，乳頭狀腺癌20例，黏液腺癌14例，印戒細(xì)胞癌12例;分化程度為高、中分化50例，低分化30例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例，術(shù)后復(fù)發(fā)29例。留取同組病例的癌旁組織(均距腫瘤邊緣5 cm)80份(癌旁組)作為對(duì)照。

1.2 試劑 c-FLIP濃縮型兔抗人多克隆抗體(美國(guó)Neomarkers公司)，抗體稀釋濃度為1∶100。NF-κB p65濃縮型鼠抗人單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)，抗體稀釋濃度為1∶100。即用型快捷MaxvisionTM檢測(cè)試劑盒(福州邁新生物技術(shù)科技公司)。

1.3 c-FLIP、NF-κB p65 的檢測(cè) 采用免疫組化Envision兩步法。整個(gè)過(guò)程按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。每批染色均設(shè)已知陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照，用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對(duì)照。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn):c-FLIP表達(dá)產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞(見(jiàn)圖1)。NF-κB p65的陽(yáng)性表達(dá)以細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕褐色顆粒為準(zhǔn)(見(jiàn)圖2)。由兩位醫(yī)師采用雙盲法觀察每張切片。陽(yáng)性判斷根據(jù)染色程度和免疫陽(yáng)性細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞總數(shù)百分比綜合記分。按切片中癌細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分:0分細(xì)胞無(wú)顯色，1分呈淡黃色，2分呈棕黃色，3分呈棕褐色(染色深淺需與背景著色相對(duì)比);再按切片中陽(yáng)性癌細(xì)胞數(shù)所占百分比打分:0分為陰性，1分為陽(yáng)性癌細(xì)胞≤10%，2分為11% ～50%，3分為50% ～75%，4分為75%以上。染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞百分比的乘積＞3分計(jì)為陽(yáng)性。

圖1 c-FLIP在胃癌中表達(dá)陽(yáng)性(Envision兩步法，100×)

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)比較用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析用Spearman相關(guān)分析法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

圖2 NF-κB p65在胃癌中表達(dá)陽(yáng)性(Envision兩步法，100×)

2 結(jié)果

2.1 c-FLIP、NF-κB p65的表達(dá) 胃癌組、癌旁組c-FLIP 陽(yáng)性率分別為 67.50%(54/80)、45.00%(36/80)，NF-κB p65 陽(yáng)性率分別為 70.00(56/80)、51.25%(41/80)，P 均 ＜0.05。

2.2 c-FLIP、NF-κB p65 的表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系 見(jiàn)表1。由表1可知，c-FLIP的表達(dá)與胃癌臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)(χ2值分別為 0.039、0.019、0.035、0.028，P 均 ＜0.05)，NF-κB p65 的表達(dá)與胃癌浸潤(rùn)深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(χ2值分別為 0.019、0.012、0.001，P 均 ＜0.05)。

表1 c-FLIP、NF-κB p65表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3 相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)分析示，c-FLIP和NF-κB p65在胃癌組織中表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.303，P=0.006)。

3 討論

細(xì)胞凋亡是一種由基因控制的自主性有序死亡，是生理性細(xì)胞死亡過(guò)程，對(duì)保持正常生長(zhǎng)及自身穩(wěn)定有十分重要意義。腫瘤細(xì)胞通過(guò)影響內(nèi)源性及外源性的機(jī)制來(lái)逃避凋亡。c-FLIP是Fas/FasL細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑的抑制蛋白，在腫瘤壞死因子受體超家族的死亡受體抑制中扮演重要角色。FLIP的死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域與FAD和Caspase-8結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性抑制Caspase-8結(jié)合到死亡誘導(dǎo)復(fù)合體上，從而阻斷了Fas介導(dǎo)的凋亡信號(hào)的傳導(dǎo)［1］。研究表明，c-FLIP具有雙重功能，F(xiàn)asL和c-FLIP的濃度對(duì)信號(hào)的傳導(dǎo)具有決定性作用，高濃度存在于細(xì)胞中時(shí)會(huì)抑制Fas介導(dǎo)的凋亡;相反，在低濃度或生理情況下，則發(fā)揮促凋亡作用［1，2］。故推測(cè) c-FLIP 過(guò)量表達(dá)在腫瘤發(fā)生中起重要作用。Ryu等［3］檢測(cè)了52例大腸腺癌組織，其陽(yáng)性表達(dá)率為78.8%，顯著高于大腸息肉和癌旁正常組織。本研究胃癌組c-FLIP陽(yáng)性率明顯高于癌旁組，提示胃癌組織中c-FLIP蛋白表達(dá)水平增高，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展。本研究還發(fā)現(xiàn)，c-FLIP的高表達(dá)與胃癌臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)，提示其在胃癌的發(fā)展過(guò)程中亦起著十分重要的作用。

NF-κB是1986年Sen和Baltimore首先從B淋巴細(xì)胞核抽提物中檢出的，其是可與免疫球蛋白的輕鏈基因增強(qiáng)子κB序列特異結(jié)合的核蛋白因子，最常見(jiàn)的是以p50/p65異二聚體形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)NF-κB結(jié)合位點(diǎn)接受多種免疫刺激，如腫瘤壞死因子、IL-1、脂多糖等激活蛋白激酶，致使NF-κB的抑制物IκB磷酸化而解離，NF-κB二聚體被激活進(jìn)入細(xì)胞核，從而激活基因表達(dá)［4］。在腫瘤發(fā)生的實(shí)驗(yàn)研究中，NF-κB的組成型激活與致瘤性轉(zhuǎn)化有關(guān)［5］。研究發(fā)現(xiàn)，在多種惡性腫瘤均有NF-κB的激活，NF-κB可能通過(guò)調(diào)控與細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、抗凋亡、血管生成和轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因表達(dá)有關(guān)，促進(jìn)了惡性腫瘤的發(fā)展［6］。本研究胃癌組NF-κB陽(yáng)性率明顯高于癌旁組，且表達(dá)與胃癌浸潤(rùn)深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)，雖與Biswas等［7］研究結(jié)果不盡相同，但亦提示其在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮著重要的作用，對(duì)胃癌的預(yù)后與治療有一定的指導(dǎo)意義。

從理論上分析，c-FLIP基因編碼序列中存在κB位點(diǎn)，故腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)活化的NF-κB蛋白可以上調(diào)FLIP的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞免于Fas、TRAIL介導(dǎo)的凋亡信號(hào)的調(diào)控［8］。Kataoka 等［9］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LIP誘導(dǎo)NF-κB激活能被負(fù)相TRAF2顯著抑制，并且內(nèi)源性TRAF2特異的與FLIP相互作用，形成FLIPCaspase-8-TRAF2三聚復(fù)合體結(jié)構(gòu)為誘導(dǎo)NF-κB激活所必需。另有許多文獻(xiàn)報(bào)道，抑制腫瘤細(xì)胞的NF-κB活性可提高TRAIL的促凋亡作用，并有 c-FLIP的表達(dá)下降，提示NF-κB通路可能通過(guò)FLIP來(lái)抑制 TRAIL的促凋亡作用［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，c-FLIP和NF-κB p65在胃癌中表達(dá)呈正相關(guān)，提示兩者在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起著協(xié)同作用。

總之，c-FLIP、NF-κB p65 高表達(dá)在胃癌的發(fā)生及發(fā)展中起重要作用，兩者可能是胃癌細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中重要的一環(huán)，但其具體作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究闡明。聯(lián)合檢測(cè)兩者在胃癌中的表達(dá)情況對(duì)胃癌診斷、病情進(jìn)展的評(píng)估及預(yù)后判斷有重要意義，并可為胃癌的基因靶向治療提供了新的途徑。

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