魏曉麗，張 玉，劉敏麗，景彩萍，成延萍

(1延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，陜西 延安 716000;2延安市人民醫(yī)院)

生存素(Survivin)是新發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白(IAP)基因家族的新成員，在人類大多數(shù)腫瘤組織中豐富表達(dá)，其抗凋亡作用可通過Caspase途徑和非Caspase途徑實(shí)現(xiàn)。細(xì)胞核增殖抗原(Ki67)是一種與增殖細(xì)胞相關(guān)的核抗原，是近年來認(rèn)為能更好評估腫瘤細(xì)胞增殖活性的重要標(biāo)志物［1，2］。本研究采用免疫組化法對乳腺癌組織中Survivin、Ki67進(jìn)行檢測，觀察其表達(dá)變化并探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬教學(xué)醫(yī)院病理科2004年1月～2007年1月手術(shù)切除的乳腺癌組織標(biāo)本82例份作為研究對象(腫瘤組)，患者均為女性，年齡30～67歲，平均46.2歲。所有患者術(shù)前均未經(jīng)放療、化療、免疫治療等抗腫瘤治療且均經(jīng)過病理證實(shí)。月經(jīng)狀況:絕經(jīng)前44例，絕經(jīng)后38例;腫瘤直徑:＜2 cm 21例，2～5 cm 47例，＞5 cm 14例;病理學(xué)類型:浸潤性導(dǎo)管癌73例，浸潤性小葉癌6例，其他類型癌3例;組織學(xué)分級:Ⅰ級21例，Ⅱ級42例，Ⅲ級19例;TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期58例，Ⅲ～Ⅳ期24例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移:無35例，有47例;ER:陰性39例，陽性43例;PR:陰性42例，陽性40例。另選同期乳腺增生性病變組織20例份(增生組)，癌旁正常乳腺組織10例份(正常組)。各組一般資料無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，具有可比性。

1.2 Survivin、Ki67檢測方法 所有標(biāo)本均采用10%甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)4～5 μm切片。采用免疫組化SP法。Survivin兔抗人多克隆抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品，Ki67/ER/PR鼠抗人單克隆抗體、免疫組化SP試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。實(shí)驗(yàn)主要步驟:石蠟包埋組織切片常規(guī)脫蠟至水，3%過氧化氫室溫15 min阻斷內(nèi)源性過氧化酶，微波修復(fù)抗原95～98℃，15～20 min，滴加一抗(多抗Survivin、單抗Ki67/ER/PR工作液)4℃過夜，依次滴加生物素化二抗，辣根酶標(biāo)記鏈霉菌卵白素工作液，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水至透明封片，顯微鏡觀察。用PBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性片作陽性對照。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn):Survivin染色陽性產(chǎn)物為黃色、棕黃色顆粒，定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。每例在400倍光鏡下觀察5個(gè)視野，計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞百分率，凡染色強(qiáng)度明顯高于背景者為陽性表達(dá)，將陽性細(xì)胞按其數(shù)量及染色強(qiáng)度分級:弱陽性(+)，陽性細(xì)胞百分率＜10%，顯色強(qiáng)度為淡黃或僅個(gè)別細(xì)胞呈黃至棕黃色;中度陽性(++)，陽性細(xì)胞百分率10% ～60%，顯色強(qiáng)度介于弱陽性與強(qiáng)陽性之間;強(qiáng)陽性(+++)，陽性細(xì)胞百分率60%以上，多數(shù)細(xì)胞呈黃至棕黃色;染色強(qiáng)度與背景無明顯差別者為陰性(－)。利用HMIA2000高清晰度彩色圖文分析系統(tǒng)，將陽性細(xì)胞的染色強(qiáng)度轉(zhuǎn)化為量化指標(biāo)，測得其平均光密度(OD)值。Ki67/ER/PR染色陽性產(chǎn)物棕黃顆粒定位于細(xì)胞核內(nèi)，增殖活性以Ki67標(biāo)記指數(shù)(LI)代表，每例選10個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，共計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算Ki67陽性細(xì)胞所占百分比，即為LI。Ki67標(biāo)記指數(shù)越大，反映處于增殖階段的細(xì)胞數(shù)量越多，細(xì)胞增殖越活躍。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman法。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組Survivin和Ki67的表達(dá) 見表1。

表1 各組Survivin和Ki67的表達(dá)()

表1 各組Survivin和Ki67的表達(dá)()

注:與正常組比較，*P ＜0.01;與增生組比較，△P ＜0.01

組別 n Survivin(OD值) Ki67(LI)腫瘤組 82 0.517±0.047＊△ 23.85±11.46＊△增生組 20 0.327 ±0.054* 10.48 ± 5.19*正常組10 0.039 ±0.026 3.51 ± 2.64

2.2 相關(guān)性分析 乳腺癌組織中Survivin表達(dá)與Ki67 表達(dá)呈正相關(guān)(r=6.821，P ＜0.05)，提示 Survivin陽性表達(dá)的乳腺癌中癌細(xì)胞增殖活性明顯增加。

2.3 Survivin表達(dá)與乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系見表2。Survivin表達(dá)與乳腺癌TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P均＜0.05)，而與月經(jīng)狀況、腫瘤直徑、病理學(xué)類型、組組學(xué)分級、ER、PR無相關(guān)性(P均＞0.05)。詳見表 2。

表2 Survivin表達(dá)與乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.4 Survivin表達(dá)與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系 Survivin陽性及陰性表達(dá)患者5年生存率分別為63.9%(39/61)、90.5%(19/21)，兩者比較，P ＜0.05。

3 討論

乳腺癌的發(fā)生與其他惡性腫瘤一樣，是一個(gè)多基因參與并經(jīng)過多步驟的復(fù)雜過程，其中細(xì)胞增殖和凋亡平衡失調(diào)是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要因素［3］。正常細(xì)胞的增殖、分化和凋亡處于平衡狀態(tài)，凋亡抑制有利于細(xì)胞的增殖，并有利于異常基因的進(jìn)一步積聚，促使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，從而有助于腫瘤的發(fā)生進(jìn)展。Survivin作為IAP家族中目前發(fā)現(xiàn)的惟一同時(shí)參與細(xì)胞凋亡與周期調(diào)控的分子，對維持細(xì)胞快速增殖及腫瘤細(xì)胞的生理功能具有非常重要的作用。Survivin參與細(xì)胞的生長和分化，其分布具有明顯的組織差異性，在胚胎發(fā)育過程中表達(dá)，在正常分化成熟的組織中不表達(dá)，而在腫瘤組織中又重新表達(dá)，因此與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)［4］。本研究顯示，與正常組比較，增生組及腫瘤組Survivin OD值明顯升高，提示Survivin的表達(dá)發(fā)生在乳腺癌惡性轉(zhuǎn)化的早期，在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，Survivin在乳腺癌中的高表達(dá)，有望成為乳腺癌基因治療的靶點(diǎn)。本研究還發(fā)現(xiàn)，Survivin表達(dá)與乳腺癌絕經(jīng)情況、腫瘤直徑、病理學(xué)類型、組織學(xué)分級、ER、PR狀態(tài)無相關(guān)性，而與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性。說明正常細(xì)胞脫離原組織時(shí)即啟動凋亡程序，不會形成遠(yuǎn)隔部位的增殖，而癌細(xì)胞由于Survivin對凋亡的抑制，細(xì)胞得以繼續(xù)分裂，造成腫瘤鄰近和遠(yuǎn)隔部位轉(zhuǎn)移灶的形成。因此，我們推斷乳腺癌中Survivin陽性患者有較高的惡性度，更具有侵襲性，對乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移起促進(jìn)作用，Survivin在乳腺癌組織中高表達(dá)與其生物學(xué)特性密切有關(guān)，可作為判斷乳腺癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的一個(gè)指標(biāo)。本研究Survivin陽性表達(dá)患者5年生存率明顯低于陰性表達(dá)患者，此與國內(nèi)外等報(bào)道相近［5，6］。說明 Survivin陰性表達(dá)者生存時(shí)間高于陽性者，提示Survivin陽性表達(dá)的乳腺癌患者預(yù)后不良。

Ki67是與細(xì)胞增殖相關(guān)的核抗原，只在增殖細(xì)胞G1、S、G2和M期表達(dá)，Ki67抗體是正對處于增殖周期的人類細(xì)胞核抗原的抗體，因其半衰期短，細(xì)胞脫離增殖周期后迅速降解，檢測結(jié)果的可靠性優(yōu)于半衰期長的增殖細(xì)胞核抗原，因此被視為較可靠的全面反映細(xì)胞群體增殖活性的指標(biāo)［7，8］。本研究顯示，與正常組比較，增生組及腫瘤組Ki67 LI明顯升高，表明在乳腺癌和乳腺增生性病變組織中存在異?；钴S的細(xì)胞群體增殖，腫瘤的高增殖又與腫瘤浸潤生長和轉(zhuǎn)移有關(guān)，因此Ki67的高表達(dá)與腫瘤患者的預(yù)后不良相關(guān)［9］。本文還發(fā)現(xiàn)，Survivin表達(dá)與Ki67表達(dá)呈正相關(guān)，提示Survivin不僅參與凋亡的調(diào)控，還可能促進(jìn)了細(xì)胞增殖，從而通過抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞增殖的雙重作用來促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展［10］。

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