李 利，高會影，楊威威，李 方，程建新

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，石家莊 050011)

子宮內(nèi)膜癌為女性生殖道常見惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率呈上升趨勢。一般認(rèn)為，長期持續(xù)的無孕激素拮抗的雌激素暴露是子宮內(nèi)膜癌的病因之一。然而，隨著對雌激素研究的深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)雌激素的代謝產(chǎn)物與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。醌氧化還原酶1(NQO1)是真核細(xì)胞內(nèi)普遍存在的一類黃素蛋白酶，其定位于人類染色體16p22。該酶催化醌雙電子還原反應(yīng)，對醌及其衍生物有解毒作用［1］，且能夠解除醌類物質(zhì)對細(xì)胞的毒害，從而起到保護(hù)細(xì)胞的作用，是人體內(nèi)一種重要的化學(xué)致癌物代謝酶。NQO1第六位外顯子(C609T)、第四位外顯子(C465T)為非同義編碼單核苷酸多態(tài)，可引起蛋白質(zhì)編碼氨基酸序列改變從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能的改變，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。本研究觀察分析了NQO1基因C609T、C465T單核苷酸多態(tài)性與子宮內(nèi)膜癌易感性的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2006～2008年河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院經(jīng)病理學(xué)檢查確診的子宮內(nèi)膜癌患者209例(觀察組)，年齡(54.21 ±8.84)歲;其中子宮內(nèi)膜透明細(xì)胞癌2例，子宮內(nèi)膜腺棘細(xì)胞癌5例，子宮內(nèi)膜鱗狀細(xì)胞癌1例，未分化癌1例，其余均為子宮內(nèi)膜腺癌;采用2000年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)的手術(shù)病理分期，Ⅰ期150例，Ⅱ期49例，Ⅲ期10例。另選同一地區(qū)的健康女性個(gè)體209例(對照組)，年齡(53.40±9.76)歲。兩組均為漢族人，且均無煙酒嗜好，無婦科腫瘤陽性家族史，絕經(jīng)后婦女無激素替代治療史。兩組一般資料無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，具有可比性。

1.2 NQO1基因C609T、C465T多態(tài)性檢測 抽取研究對象外周靜脈血5 mL，以枸櫞酸鈉抗凝，采用蛋白酶K-氯化鈉鹽析法提取白細(xì)胞DNA。采用聚合酶鏈反應(yīng)—限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(PCRRFLP)方法對NQO1 C609T和C465T進(jìn)行基因分型。擴(kuò)增 NQO1C609T特異性:5'-TCTTACTGAGAAGCCCAGACCAACT-3'，5'-CTCCAGGCGTTTCTTCCATCC-3'，212 bp。擴(kuò)增 NQO1 C465T 特異性:5'-TATCTAGCTTTACTCGGACCCACTC-3'， 5'-CATTCAGAACCATCCACCTACCC-3'，380 bp，20 μL。其中模板DNA 100 ng，10×PCR(含 MgCl215 mM)緩沖液2.4 μL，染料 2.0 μL，Taq DNA 聚合酶 1.0 U，dNTPs 200 μM和上、下游引物各250 nM。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min，然后94℃變性45 s、59℃(NQO1 C609T)或60℃(NQO1 C465T)退火45 s、72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)后，72℃繼續(xù)延伸7 min。2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物分別經(jīng) HinfⅠ(NQO1 C609T)和 MspⅠ(NQO1 C465T)限制性內(nèi)切酶于37℃和55℃消化過夜后，分別進(jìn)行4%與5%瓊脂糖凝膠電泳分析基因型。NQO1 C609T的野生型C/C型為212 bp，突變型T/T型為129 bp和83 bp，雜交型C/T型為212 bp、129 bp和83 bp。NQO1 C465T的野生型C/C型為356 bp和24 bp，突變型T/T型為380 bp，雜交型T/C型為380 bp、356 bp 和24 bp。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件。對照組基因型頻率分布行χ2檢驗(yàn)做Hardy-Weinberg平衡分析。兩組年齡差異采用t檢驗(yàn)，兩組等位基因及基因型分布的差異用χ2檢驗(yàn)分析，以非條件Logistic回歸方法計(jì)算表示相對風(fēng)險(xiǎn)度的比值比(OR)及其95%可信區(qū)間(CI)。采用EH軟件分析NQO1基因單體型頻率，2LD軟件分析連鎖不平衡狀態(tài)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NQO1 C609T基因型及等位基因頻率分布結(jié)果見表1。

表1 NQO1 C609T基因型及等位基因頻率分布(n=209)

2.2 NQO1 C465T基因型及等位基因頻率分布結(jié)果見表2。由表2可知，各組基因型及等位基因比較，P 均 ＞0.05。

表2 NQO1 C465T基因型及等位基因頻率分布(n=209)

2.3 兩組不同初潮年齡者 NQO1 C609T、NQO1 C465T基因型分布 結(jié)果見表3。

2.4 兩組不同絕經(jīng)情況者 NQO1 C609T、NQO1 C465T基因型分布 結(jié)果見表4。

表3 不同初潮年齡NQO1 C609T、NQO1 C465T基因型分布

表4 不同絕經(jīng)情況NQO1 C609T、NQO1 C465T基因型分布

3 討論

本研究探討了NQO1 C609T和NQO1 C465T單核苷酸多態(tài)與子宮內(nèi)膜癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系，結(jié)果顯示NQO1 C609T單核苷酸多態(tài)與子宮內(nèi)膜癌的遺傳易感性相關(guān)，C/T、T/T基因型可能是子宮內(nèi)膜癌發(fā)病的潛在危險(xiǎn)因素。而NQO1 C465T單核苷酸多態(tài)與子宮內(nèi)膜癌的遺傳易感性未見明顯關(guān)聯(lián)。

研究表明，NQO1具有抑制腫瘤發(fā)生的作用。其機(jī)制可能為:①NQO1是一種黃素酶，能夠催化醌還原為親電子的水溶性醌，避免了親核性醌損傷DNA。②研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染并表達(dá)NQO1活性的乳腺癌系MCF-7在TNF-α作用下凋亡敏感性明顯增加，此過程可能與NQO1增加呼吸鏈電子流量，增加TNF-α的凋亡效應(yīng)產(chǎn)物的生成有關(guān)。③NQO1對P53蛋白穩(wěn)定性有調(diào)節(jié)作用，特別當(dāng)細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，這種對P53蛋白的穩(wěn)定作用更加突出，從而能使受損的細(xì)胞及時(shí)停止生長進(jìn)行修復(fù)或調(diào)節(jié)發(fā)生凋亡［2］。目前發(fā)現(xiàn)，人的NQO1基因序列中，引起蛋白質(zhì)編碼氨基酸序列改變的非同義編碼單核苷酸多態(tài)有3個(gè)，其中包括位于第四位外顯子的C465T和第六位外顯子的C609T，分別引起所編碼的139位氨基酸由色氨酸變?yōu)榫彼幔?87位氨基酸由脯氨酸變?yōu)榻z氨酸。這些蛋白質(zhì)編碼氨基酸序列的改變，可能導(dǎo)致了個(gè)體中此酶活性的降低或缺失，減弱了NQO1對醌類化合物的解毒作用及改變腫瘤對特定原癌基因及抑癌基因功能的影響，從而使機(jī)體患腫瘤的可能性增加［3］。

近年來，人們對于NQO1 C609T的研究越來越深入，不同人群NQO1 C609T基因多態(tài)性的研究結(jié)果存在一定差異［4］。已有研究表明，純和野生基因型C/C具有完全的NQO1酶活性，雜合基因型C/T的酶活性較純和野生型降低3倍，純和突變基因型T/T的酶活性則完全喪失［5］。因此，具有突變純合子的人群是腫瘤高危易感人群。據(jù)報(bào)道，NQO1 C609T基因多態(tài)性與多種腫瘤如白血病、肺癌、大腸癌等發(fā)生有關(guān)聯(lián)［6～8］。Smith 等［9］用 PCR-RFLP 方法在研究成人白血病與NQO1的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，低NQO1活性［具有C/T或T/T基因型］可增加患白血病的危險(xiǎn)性。本研究發(fā)現(xiàn)，NQO1 C609T單核苷酸多態(tài)與子宮內(nèi)膜癌的遺傳易感性相關(guān)，C/T、T/T基因型可能是子宮內(nèi)膜癌發(fā)病的潛在危險(xiǎn)因素。當(dāng)然也有不同的報(bào)道，認(rèn)為攜帶T/T、C/T基因型者并沒有顯著增加腫瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)［10～13］。

以往，對于NQO1 C465T研究尚不多見，其與子宮內(nèi)膜癌的研究鮮有報(bào)道。文獻(xiàn)報(bào)道，不同人群NQO1 C465T等位基因頻率較低，高加索人群為5%，加拿大人群為 1%［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，NQO1 C465T單核苷酸多態(tài)與子宮內(nèi)膜癌的遺傳易感性未見明顯關(guān)聯(lián)。應(yīng)考慮到該位點(diǎn)的突變率較低，導(dǎo)致多態(tài)性改變與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的關(guān)系不顯著。

總之，NQO1 C609T多態(tài)與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病存在關(guān)聯(lián)，攜帶T等位基因可能增加子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

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