劉振華，仉烈煒，趙佳麗，張清華，王敏忠

(1 山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院，濟(jì)南250021;2 山東中醫(yī)藥大學(xué))

腦出血具有高致殘率及致死率。研究證實(shí)，腦出血后血腫灶周存在炎性反應(yīng)及炎性因子表達(dá)，是神經(jīng)元繼發(fā)性損害及神經(jīng)功能障礙加重的原因之一［1，2］。微創(chuàng)血腫清除術(shù)能快速緩解血腫壓迫，減輕各種炎性細(xì)胞因子對(duì)周圍腦組織的損傷［3］。2010年11月～2011年3月，我們觀察了不同時(shí)機(jī)微創(chuàng)血腫清除術(shù)對(duì)大鼠腦出血灶周圍組織IL-6、IL-1β水平的影響，探討其表達(dá)變化及對(duì)神經(jīng)功能的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康成年雄性Wistar大鼠90只，體質(zhì)量260～320 g(購(gòu)自山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。大鼠腦立體定向儀(STOELTNGCO.620 WHEATLANE型，美國(guó));微量注射儀(瑞沃德生命科技有限公司);微量注射器10 μL(上海高鴿工貿(mào)有限公司);ISP免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組及模型制備 將90只大鼠隨機(jī)分為三組，分別為模型組、微創(chuàng)組和對(duì)照組，每組各30只。參照Rosenberg等［4］報(bào)道的方法制備模型組、微創(chuàng)組大鼠腦出血模型。用10%的水合氯醛腹腔麻醉大鼠(350 mg/kg)，將其俯臥位固定在立體定位儀上，沿頭皮正中切一長(zhǎng)約10 mm切口，暴露前囟，于前囟前0.2 mm中線旁開(kāi)3 mm處鉆一直徑0.5 mm的小孔，進(jìn)針深度為5.5 mm，即尾殼核位置。剪尾取血，8 min內(nèi)用微量進(jìn)樣器緩慢注入自體未抗凝動(dòng)脈血50 μL，留針10 min，退針后局部用骨蠟封閉后縫合皮膚。對(duì)照組僅在尾殼核位置注射生理鹽水50 μL，其余過(guò)程與其他兩組相同。

1.2.2 造模成功標(biāo)準(zhǔn) 采用Bederson評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)判斷模型是否成功［5］。0分:無(wú)神經(jīng)功能缺損;1分:前肢出現(xiàn)屈曲(即提尾懸空實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性);2分:一側(cè)推抵抗力下降(即側(cè)向推力實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性)，伴前肢屈曲，無(wú)轉(zhuǎn)圈行為;3分:同2分行為，伴自發(fā)性旋轉(zhuǎn)即提尾懸空實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性(自由活動(dòng)時(shí)向癱瘓側(cè)劃圈)。以評(píng)分≥2分者為造模成功。

1.2.3 微創(chuàng)血腫清除術(shù) 微創(chuàng)組大鼠腦出血造模成功后4 h，重新麻醉后固定在定位儀上，微量注射器抽取尿激酶 10 μL［6］，沿鉆孔處進(jìn)針深 6.3 mm，緩慢注入尿激酶，5 min內(nèi)注完，等待約45 min后用1 mL注射器代替微量注射器連接真空管外端，利用負(fù)壓輕柔緩慢抽吸，抽吸量為總量的30%～40%，緩慢退針常規(guī)創(chuàng)口消毒后縫合皮膚。

1.2.4 標(biāo)本采集 各組于 6、12、24、48、72 h 時(shí)分別行戊巴比妥(0.1 mL/100 g)腹腔注射，麻醉大鼠后開(kāi)胸，暴露心臟及主動(dòng)脈，用鈍頭50 mL注射器針頭從左心室尖插入心室，進(jìn)入主動(dòng)脈，用手術(shù)剪將右心耳剪開(kāi)，將37℃0.9%氯化鈉溶液從50 mL注射器緩慢推入體循環(huán)，持續(xù)3～5 min，至右心耳流出的液體基本無(wú)色，將灌流液換為4%多聚甲醛磷酸緩沖液，繼續(xù)灌流5 min約250 mL，斷頭取血腫靠近皮層側(cè)的腦組織約2 mm×2 mm×2 mm，留大腦置于4%多聚甲醛后固定24 h以上。取出固定液中腦組織標(biāo)本，常規(guī)脫水、石蠟包埋，固定腦組織。

1.2.5 腦出血灶周周組織中IL-6、IL-1β 檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)染色。取尾狀核平面切片，按常規(guī)免疫組化技術(shù)(PAP法)分別進(jìn)行染色。然后在光鏡下觀察炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等情況。IL-6、IL-1β免疫組化染色均著色于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)和胞膜可見(jiàn)棕黃色顆粒。在緊貼血腫周圍但不包括血腫區(qū)每張切片隨機(jī)取4個(gè)不重復(fù)高倍視野，計(jì)算每個(gè)高倍視野下的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。所有切片均在同一強(qiáng)度下、同一放大倍數(shù)下分析，取每一時(shí)間點(diǎn)的高倍視野下陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)平均數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，各組數(shù)據(jù)以表示，組間比較用t檢驗(yàn)，多組、多時(shí)點(diǎn)的比較采用Post-hoc方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

模型組 6、12、24、48、72 h 時(shí) IL-6、IL-1β 陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)高于對(duì)照組及手術(shù)組(P均＜0.05);手術(shù)組各時(shí)點(diǎn)IL-6、IL-1β陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)少于模型組(P均 ＜0.05);手術(shù)組各時(shí)點(diǎn) IL-6、IL-1β 陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)多于對(duì)照組(P均＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腦出血灶周組織IL-6、IL-1β 的表達(dá)(個(gè)/HP，)

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腦出血灶周組織IL-6、IL-1β 的表達(dá)(個(gè)/HP，)

注:與對(duì)照組比較，△P ＜0.05;與模型組比較，*P ＜0.05

組別 n IL-6陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) IL-1β陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)模型組306 h 47.83 ±16.74 20.37 ±4.16△12 h 66.29 ±18.13 37.58 ±4.34△24 h 68.26 ±19.22 44.29 ±4.21△48 h 73.82 ±19.22 55.32 ±4.26△72 h 82.31 ±17.42 73.71 ±3.98△微創(chuàng)組 306 h 34.67 ±17.21 13.23 ±3.35*12 h 42.72 ±17.33 26.44 ±3.21*24 h 43.53 ±18.24 34.47 ±3.43*48 h 56.42 ±18.22 43.83 ±3.39*72 h 63.71 ±17.83 58.56 ±3.15*對(duì)照組 306 h 21.05 ± 7.62 11.05 ±5.3012 h 27.23 ±11.20 17.32 ±3.2024 h 32.31 ±12.22 21.61 ±4.0848 h 37.52 ±16.24 25.91 ±3.8172 h 42.20 ±11.33 24.35 ±4.28

3 討論

腦出血后，血腫灶周圍腦組織存在炎性反應(yīng)，并表達(dá)多種炎性因子，可導(dǎo)致血腫周圍腦組織神經(jīng)功能缺損，進(jìn)一步造成血腦屏障破壞。急性期出血灶周圍腦組織表達(dá)包括IL-6及IL-1β等多種炎性細(xì)胞因子。IL-6是分子量為26 kD的細(xì)胞因子，存在于機(jī)體多種組織、血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及某些腫瘤細(xì)胞中，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有保護(hù)及神經(jīng)毒性的雙重作用［7］。正常情況下，IL-6能夠促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)，還可以促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)及分化，抑制IL-1的合成，對(duì)神經(jīng)元有保護(hù)作用。腦出血后灶周腦組織受到損傷時(shí)，膠質(zhì)細(xì)胞可誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-6。升高的IL-6可引起一系列神經(jīng)損傷:IL-6刺激B細(xì)胞在肝臟合成急性反應(yīng)蛋白和纖維蛋白原;抑制前列腺素I2的產(chǎn)生，引起血管收縮，加重腦水腫;還可增加細(xì)胞間黏附分子的表達(dá)，使白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附性增強(qiáng)，導(dǎo)致微循環(huán)障礙，加重血腦屏障破壞和神經(jīng)功能損害［8］。IL-1β是多形核白細(xì)胞的直接和間接趨化因子，可以通過(guò)刺激內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)白細(xì)胞黏附分子，使白細(xì)胞聚集于缺血腦組織，從而加重腦缺血損傷，是觸發(fā)免疫和炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)［9］。研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β作為一種炎癥和免疫源性細(xì)胞因子，刺激花生四烯酸的代謝，增加氧自由基的釋放，誘導(dǎo)一氧化氮合酶生成，使一氧化氮合成、釋放增加，產(chǎn)生神經(jīng)毒性;誘導(dǎo)興奮性氨基酸，啟動(dòng)多種細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng);還可刺激內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)白細(xì)胞黏附分子，使白細(xì)胞聚集在缺血組織，加重腦組織損傷［10］。

腦出血后血腫穿刺清除術(shù)的最佳治療時(shí)機(jī)尚無(wú)定論。從手術(shù)角度多考慮為出血后4～8 d，這時(shí)血腫大部分液化，有利于清除，也不易引起再出血，但導(dǎo)致腦損傷程度加重，故遠(yuǎn)期療效不佳。本研究發(fā)現(xiàn)，腦出血后6 h各組大鼠即可見(jiàn)血腫周圍組織中有IL-6、IL-1β陽(yáng)性的神經(jīng)細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞，隨時(shí)間推移，表達(dá)逐漸增加增強(qiáng)，到72 h達(dá)到高峰，說(shuō)明在腦出血早期即有腦內(nèi)的炎癥因子激活。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，模型組與對(duì)照組比較，IL-6、IL-1β陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)均增多，提示在腦出血后炎癥反應(yīng)起了重要作用。而微創(chuàng)組IL-6、IL-1β陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)表達(dá)雖多于對(duì)照組，但低于模型組，說(shuō)明超早期(出血后6 h內(nèi))及時(shí)行血腫清除術(shù)，不僅解除血腫壓迫引起的腦損傷，同時(shí)減輕了炎性因子繼發(fā)的神經(jīng)功能損害。

綜上所述，腦出血后血腫灶周炎性細(xì)胞因子IL-6和IL-1β的表達(dá)增高是引起出血后神經(jīng)系統(tǒng)損害的重要因素。超早期(出血后6 h內(nèi))進(jìn)行血腫穿刺清除術(shù)可以及時(shí)解除血腫壓迫，能夠降低血腫灶周炎性細(xì)胞因子對(duì)腦組織的損害，保護(hù)血腦屏障，減輕腦水腫，最大限度減輕腦出血后神經(jīng)功能的損傷，從而起到腦保護(hù)的作用。

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