徐建亞， 徐 珊， 陳 超， 李佳曦， 單進(jìn)軍， 汪受傳

(南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院兒科研究所，江蘇南京210046)

呼吸道合胞病毒 (Respiratory Syncyntial Virus，RSV)是引起嬰幼兒下呼吸道感染的主要病原，可導(dǎo)致嬰幼兒感染肺炎和支氣管炎［1］。目前臨床上治療或預(yù)防RSV疾病的藥物主要是核苷類似物利巴韋林 (病毒唑)與帕利珠單抗，但均有其局限性［2］。

金欣口服液 (麻黃、苦杏仁、生石膏、葶藶子、桑白皮、前胡、黃芩、虎杖組成)，由南京中醫(yī)藥大學(xué)博導(dǎo)、中醫(yī)兒科名醫(yī)汪受傳教授領(lǐng)銜研制，治療RSV肺炎療效顯著優(yōu)于利巴韋林注射液且臨床使用安全［3］。為了探索金欣口服液治療RSV肺炎的物質(zhì)基礎(chǔ)，前期本課題組研究了黃芩(復(fù)方組分之一)的主要有效成分黃芩苷對(duì)RSV復(fù)制周期的影響，發(fā)現(xiàn)黃芩苷不能抑制RSV的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及融合［4］。金欣口服液另一主要組分是具抗病毒、抗菌作用的清熱解毒中藥虎杖。國(guó)內(nèi)外大量文獻(xiàn)報(bào)道，虎杖的主要活性成分白藜蘆醇 (Resveratrol)除抗腫瘤等生物活性外，還有抗病毒、抗炎等作用［5-6］。Drago等［7］研究表明白藜蘆醇具有抗RSV的作用，而關(guān)文達(dá)等［8］研究結(jié)果相反。

為進(jìn)一步探討金欣口服液藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，研究白藜蘆醇的抗RSV活性及其作用機(jī)制，從RSV感染周期角度開(kāi)展了以下相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 材料 Hep-2(人喉癌上皮細(xì)胞)，中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。Hep-2采用含10%小牛血清 (FCS)的DMEM培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)。

RSV(Long株)，武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，于Hep-2細(xì)胞上擴(kuò)增。以細(xì)胞病變法測(cè)定RSV半數(shù)細(xì)胞感染量 (TCID50)［4］。

白藜蘆醇，中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):111535-200502，純度95%以上。RSV的F蛋白抗體 (小鼠抗人)，F(xiàn)luor Alex488標(biāo)記二抗 (羊抗小鼠)，Invitrogen公司。RSV核酸測(cè)定試劑盒，上海之江生物科技有限公司。 ［3H］CTP(-20 Ci/mmol)，MA 02118，Boslon公司。

1.2 白藜蘆醇對(duì)Hep-2的最大無(wú)毒濃度測(cè)定(MTT法) Hep-2于96孔板中長(zhǎng)成單層后，漂洗后加白藜蘆醇藥液100 μL(5個(gè)濃度，分別為100、50、25、10、1 μmol/L;正常對(duì)照組換維持液)，培養(yǎng)、觀察細(xì)胞病變至72 h，并以MTT法測(cè)定白藜蘆醇對(duì)Hep-2的最大無(wú)毒濃度。

1.3 白藜蘆醇對(duì)RSV復(fù)制的影響 (RT-qPCR法)Hep-2于6孔板中生長(zhǎng)并分組:正常對(duì)照組、RSV感染模型組、白藜蘆醇干預(yù)組，分別簡(jiǎn)稱正常組、病毒組、白藜蘆醇組。至細(xì)胞數(shù)達(dá)5×107以上時(shí)，接種0.2 mL 100 TCID50的RSV液 (正常組除外)。吸附1.5h后 (37℃)，正常組、病毒組分別加全培3 mL，白藜蘆醇組加25 μmol/L藥液3 mL，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，裂解、提取總RNA，qPCR法檢測(cè)RSV mRNA水平。具體參照文獻(xiàn)［4］。

1.4 白藜蘆醇對(duì)RSV的RNA依賴的RNA聚合酶(RdRP)活性的影響 (體外轉(zhuǎn)錄法) 病毒感染及藥物干預(yù)后的Hep-2分組基本同1.3項(xiàng)所述，只是改“藥液中培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞”為藥物干預(yù)19 h后再以2 μg/mL放線菌素D處理1 h再收集細(xì)胞，分離病毒核糖體復(fù)合體 (RNP complex)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，最后用同位素法測(cè)定mRNA全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本含量。具體步驟參照Stephen的RSV poly(A)捕獲法［4，9］。轉(zhuǎn)錄摻入的放射性核苷酸 ［3H］CTP的強(qiáng)度用多功能微孔板檢測(cè)儀 (芬蘭HideX，Chameleon V型)檢測(cè)。放射強(qiáng)度與體外轉(zhuǎn)錄的mRNA全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本水平正相關(guān)，而轉(zhuǎn)錄本水平越高說(shuō)明RdRP的實(shí)際轉(zhuǎn)錄活性越高。

1.5 白藜蘆醇對(duì)RSV介導(dǎo)的細(xì)胞融合效應(yīng)的影響(IF/LSCM法) 制作Hep-2細(xì)胞爬片，培養(yǎng)18 h后接種100 TCID50RSV液0.2 mL(正常組不接種病毒)。吸附1.5 h后棄病毒液，除白藜蘆醇組加25 μmol/L藥液1 mL外，其余組均加培養(yǎng)液1 mL，培養(yǎng)48 h后進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記 (IF)及激光掃描共聚焦顯微鏡 (LSCM)觀察，具體參照文獻(xiàn)［4］。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)均采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，數(shù)據(jù)用±s表示，多組間差異采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey法。P＜0.05認(rèn)為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對(duì)Hep-2細(xì)胞的最大無(wú)毒濃度 經(jīng)細(xì)胞病變法及MTT法測(cè)定，白藜蘆醇對(duì)Hep-2細(xì)胞的最大無(wú)毒濃度為25 μmol/L，其他實(shí)驗(yàn)中均以該濃度作為白藜蘆醇的終濃度。

2.2 白藜蘆醇對(duì)RSV核酸復(fù)制的影響 RT-qPCR結(jié)果如下:與正常組相比，病毒組mRNA水平顯著升高 (P＜0.001)，表明病毒感染模型成功。與病毒模型組比較，25 μmol/L白藜蘆醇對(duì)病毒mRNA水平無(wú)顯著影響 (表1)。

表1 qPCR法測(cè)定RSV mRNA水平 (n=3，±s)Tab.1 Absolute level for RSV by qPCR(n=3，±s)

表1 qPCR法測(cè)定RSV mRNA水平 (n=3，±s)Tab.1 Absolute level for RSV by qPCR(n=3，±s)

注:與正常組比較，*P＜0.001。

組別 RSV mRNA量 (×106)正常組0.001±0.000 02病毒組 2.023±0.034*白藜蘆醇 (25 μmol/L)組2.155±0.090

2.3 白藜蘆醇對(duì)RdRP活性的影響 病毒組與正常組相比較，放射性核苷酸輻射強(qiáng)度顯著升高，25 μmol/L白藜蘆醇作用于RSV感染細(xì)胞后，輻射強(qiáng)度顯著降低 (圖1)。

圖1 白藜蘆醇對(duì)放射強(qiáng)度的影響Fig.1 Effect of resveratrol on intensity of radiation

2.4 白藜蘆醇對(duì)RSV介導(dǎo)的細(xì)胞融合的影響 IF結(jié)合LSCM實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:病毒組大面積融合形成典型融合大胞且綠色熒光強(qiáng)度高，表明細(xì)胞表達(dá)F蛋白量多;25 μmol/L白藜蘆醇作用后，熒光強(qiáng)度減弱但不顯著，表明F蛋白表達(dá)量稍減少，仍形成典型融合胞。正常組，無(wú)綠色熒光、無(wú)細(xì)胞融合。

3 討論

白藜蘆醇 (resveratrol)，一種天然活性成分，化學(xué)名為3，4'，5-三羥基-二苯乙烯，最早從毛葉藜蘆Veratrum grandiflorum中分離得到，是虎杖的主要活性成分之一?！吨袊?guó)藥典》確定其為虎杖的有效成分和質(zhì)控指標(biāo)之一。近年研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇具有多種生物學(xué)活性，其中不少研究表明其具有抗呼吸道病毒活性 (如甲 1 型流感病毒［10］、RSV［7］)。但關(guān)文達(dá)等［8］研究表明白藜蘆醇 (8.3 μg/mL)于體外抑制腺病毒7型作用，對(duì)RSV long株未見(jiàn)明顯抑制作用。以上白藜蘆醇抗RSV相關(guān)研究均僅限于細(xì)胞病變抑制法 (CPE)觀察抗病毒效應(yīng)。本課題組采用該方法研究結(jié)果表明白藜蘆醇 (25 μmol/L相當(dāng)于5.7 μg/mL)對(duì)RSV感染的 Hep-2病變具有抑制作用 (另文發(fā)表)。分析原因可能與關(guān)文達(dá)等采用的A549細(xì)胞與Hep-2相比對(duì)RSV的敏感性較差相關(guān)。

RSV感染細(xì)胞時(shí)，首先與細(xì)胞黏附，后與細(xì)胞融合并侵入細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)行核酸復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及翻譯其核衣殼蛋白，最后裝配及從細(xì)胞內(nèi)釋放子代病毒，以上過(guò)程組成其生命周期，其中任何一個(gè)階段都是潛在的抗病毒靶標(biāo)［11］。

本課題組前期研究證實(shí)了金欣口服液能抑制RSV介導(dǎo)的細(xì)胞融合，途徑之一是通過(guò)調(diào)節(jié)RSV的F蛋白表達(dá)［12］，但是該復(fù)方的主要組分之一——黃芩，其有效成分黃芩苷對(duì)RSV復(fù)制相關(guān)周期無(wú)顯著作用［4］。本實(shí)驗(yàn)中采用相同方法研究了白藜蘆醇對(duì)RSV復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及融合的影響:首先采用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)RSV的特異性RNA核酸片段，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇干預(yù)病毒感染后的細(xì)胞對(duì)RSV核酸水平無(wú)明顯影響，即白藜蘆醇不能抑制RSV在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制;進(jìn)一步采用RSV poly(A)捕獲法［9］檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)RdRP轉(zhuǎn)錄活性的影響，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能夠抑制RNP體外轉(zhuǎn)錄mRNA，即能夠抑制RSV的RdRP轉(zhuǎn)錄活性。

RSV的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄活性被抑制理論上意味著RSV核酸在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄被抑制，F(xiàn)蛋白表達(dá)量應(yīng)顯著降低，其介導(dǎo)的細(xì)胞融合亦應(yīng)被抑制，但是本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與理論不符。本實(shí)驗(yàn)采用IF結(jié)合LSCM檢測(cè)表明白藜蘆醇對(duì)RSV的F蛋白表達(dá)量及其介導(dǎo)的細(xì)胞融合抑制作用不明顯。分析原因可能如下:本實(shí)驗(yàn)采用體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)檢測(cè)RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄活性，與實(shí)際細(xì)胞內(nèi) (包括動(dòng)物體內(nèi))轉(zhuǎn)錄有差別;體內(nèi) (細(xì)胞內(nèi))轉(zhuǎn)錄過(guò)程及轉(zhuǎn)錄后翻譯可能存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，致使RSV在細(xì)胞內(nèi)的實(shí)際轉(zhuǎn)錄結(jié)果未表現(xiàn)出被抑制。白藜蘆醇抑制RSV感染的Hep-2病變效應(yīng)可能通過(guò)其他途徑實(shí)現(xiàn)的。

近年來(lái)，隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)RSV感染涉及到由多種細(xì)胞和細(xì)胞因子參與的固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，其中Toll樣受體 (TLR)，特別是TLR4、TLR3、TLR7等受體及其銜接蛋白MyD88與RSV感染關(guān)系密切［13-14］。白藜蘆醇是否通過(guò)TLRs介導(dǎo)的信號(hào)通路調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能發(fā)揮抗RSV效應(yīng)，本課題組正進(jìn)行相關(guān)研究。初步研究結(jié)果表明白藜蘆醇能夠調(diào)控RSV感染初期TLR3介導(dǎo)的信號(hào)通路及下游相關(guān)炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)。

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