張 曦， 宋君秋， 汪 云， 李 欣， 康 毅， 婁建石

(天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理教研室，天津300070)

冠心病是由于冠狀動脈固定性或動力性病變，致使血管管腔狹窄堵塞，引起心肌缺血缺氧或壞死的缺血性心臟病，是人類心血管健康的最大威脅。中醫(yī)藥治療冠心病在緩解患者癥狀、改善病理損傷方面表現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢。

冠心蘇合具有寬胸、理氣、止痛的功效，臨床用于治療冠心病心絞痛。本課題采用血清藥理學(xué)方法采集含藥血清，利用生物化學(xué)檢測手段探討冠心蘇合抗氧化損傷致心肌細胞凋亡作用機制，為臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥物、試劑及儀器 冠心蘇合膠囊 (天津宏仁堂藥業(yè)有限公司，批號102009)、Hoechst染色試劑盒 (批號:KGA211)、BCA蛋白測定試劑盒 (批號:KGPBCA)、caspase-3活性測定試劑盒(批號:KAG203)均來自凱基生物有限公司、兔抗鼠多克隆抗體Bcl-2(批號:BS1511，Bioworld公司)、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗 (批號:BS10350，Bioworld公司)、β-actin內(nèi)參 (批號:AP0060，Bioworld公司)、兔抗鼠多克隆抗體Bax(批號20110910，ABcam公司，美國)、倒置相差顯微鏡 (型號:CK40-F200，Olympus公司生產(chǎn)，日本)、CO2孵箱 (型號:3111，Thermo Electron Corporation，美國)、酶標儀 (型號:Model680，BIORAD公司生產(chǎn)，美國)、熒光顯微鏡(型號:MF41，Olympus公司，日本)Western bloting相關(guān)耗材由BIORED公司提供。

1.1.2 動物 SD大鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量230～280 g(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，動物合格證號0005984)。飼養(yǎng)條件:溫度 (22±2)℃;相對濕度40%～60%;光照周期，12/12 h，自由進食進水;SD新生乳鼠 (3 d內(nèi))，25只，雌雄不拘 (軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，合格證號0005356)。

1.2 實驗方法

1.2.1 含藥血清與空白血清的制備 取40只SD種大鼠，隨機分為正常對照組10只，冠心蘇合組30只。冠心蘇合組大鼠灌胃給予冠心蘇合膠囊，800 mg/kg，給藥體積為10 mL/kg，每日兩次，連續(xù)給藥4 d。正常對照組灌胃給予等量生理鹽水，操作同上。末次給藥后1 h，無菌條件下，經(jīng)腹主動脈充分取血，分離含藥血清。過濾除菌，分裝，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 原代乳鼠心肌細胞分離培養(yǎng)及氧化損傷模型的確立 取新生3 d內(nèi)的SD乳鼠15只，在超凈臺中剪下心臟，加入37℃ 孵育的混合消化酶液(0.05%胰蛋白酶和0.055%膠原酶Ⅱ溶液)將心肌組織消化成單細胞懸液，差速貼壁去除非心肌細胞，調(diào)整細胞密度至5×105/mL種于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，同時以1×104/孔接種于96孔板內(nèi)，加入BrdU，于37℃、5%CO2孵箱中孵育。細胞貼壁48 h后方可換液，待大部分心肌細胞有搏動時加入H2O2使其終濃度分別為 100、200、400 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)1、2、4 h，確立最合適的H2O2損傷濃度和時間。

1.2.3 實驗分組 將培養(yǎng)的心肌細胞隨機分為陰性對照組、正常血清對照組、氧化損傷模型組、冠心蘇合高劑量組 (含藥血清原液)、中劑量組 (按含藥血清原液∶DMEM=3∶1配制)和低劑量組(按含藥血清原液∶DMEM=1∶1配制)，除陰性對照組外，各組細胞在給藥后2 h均加入終濃度為100 μmol/L 的 H2O2，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。

1.2.4 MTT法檢測細胞存活率 培養(yǎng)結(jié)束后，各組細胞棄去原有培養(yǎng)基，加入 10 μL MTT(5 mg/mL)和90 μL無FBS高糖DMEM培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，小心吸取上清液，每孔加入150 μL DMSO，490 nm波長處檢測吸光度。細胞存活率 (%)=(OD檢測組/OD對照組) ×100%。

1.2.5 Hoechst33258染色形態(tài)學(xué)研究 取6孔板中穩(wěn)定搏動2 d原代心肌細胞建立H2O2氧化損傷模型，取各濃度藥物作用于心肌細胞 (實驗分組與MTT相同)，在培養(yǎng)箱中37℃孵育1 h;棄去6孔板中液體，PBS洗細胞3次;4%甲醛于4℃固定細胞10 min;棄去甲醛，PBS洗細胞2次，自然晾干;每孔加入Hoeschst33258染料150 μL，避光染色10 min后水沖凈晾干;熒光顯微鏡觀察照相。

1.2.6 caspase-3活性的測定

(1)蛋白定量

根據(jù)BCA試劑盒要求繪制蛋白標準曲線;根據(jù)標準曲線定量蛋白。

(2)caspase-3檢測

吸取50 μL細胞裂解上清 (蛋白質(zhì)量濃度為100 ～200 μg/mL);加入 50 μL 的 Reaction buffer;加入5 μL caspase-3 Substrate并于37℃避光孵育4 h;用酶標儀在波長400 nm測定其吸光值。通過計算OD誘導(dǎo)劑/OD陰性對照的倍數(shù)來確定凋亡誘導(dǎo)劑組caspase-3活化程度。

1.2.7 Western blot測定Bcl-2及Bax蛋白的表達收集各組藥物作用后的心肌細胞，裂解后BCA法進行蛋白定量;用loading buffer配制好上樣蛋白，100℃煮蛋白20 min，分裝，-20℃保存;根據(jù)蛋白分子量制備12%的分離膠和積層膠;上樣完畢后按照積層膠恒壓80 V，分離膠恒壓120 V電泳，待溴酚藍移至玻璃板最下端即可停止電泳。裝好轉(zhuǎn)膜裝置，恒流350 mA電轉(zhuǎn)2.5 h;按照marker指示切割目的條帶，室溫下封閉2 h;加入含兔抗小鼠多克隆抗體 (稀釋比例為1∶1 000)的一抗工作液，4℃過夜;TBST搖洗3次，10 min/次;加入鼠抗兔IgG抗體，25℃孵育2 h;TBST搖洗3次，將多余二抗洗凈，10 min/次;ECL超敏發(fā)光液處理目的條帶1 min，暗室中曝光，顯影，定影，待X光片干透即可掃描，用Quantity one軟件對蛋白條帶進行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 冠心蘇合含藥血清對H2O2所致乳鼠心肌細胞損傷存活率的影響 與陰性對照組比較，H2O2處理時細胞存活率顯著降低 (P＜0.01)，與模型組比較，冠心蘇合含藥血清組細胞存活率均明顯提高(P＜0.01)，且呈劑量相關(guān)性 (見表1)。

表1 冠心蘇合含藥血清對H2O2損傷的原代乳鼠心肌細胞存活率的影響(±s，n=6)Tab.1 Viability of H2O2injured primary cultured cardiomyocytes after being treated by Guanxin Suhe-containing serum for different doses(±s，n=6)

表1 冠心蘇合含藥血清對H2O2損傷的原代乳鼠心肌細胞存活率的影響(±s，n=6)Tab.1 Viability of H2O2injured primary cultured cardiomyocytes after being treated by Guanxin Suhe-containing serum for different doses(±s，n=6)

注:與陰性對照組比較，＊＊P＜0.01;與模型組比較，##P ＜0.01。

分 組 細胞存活率/%陰性對照組100模型組 33.16±4.99空白血清組 40.03 ±3.24＊＊冠心蘇合低劑量組 49.72±4.32＊＊##冠心蘇合中劑量組 70.75±3.95＊＊##冠心蘇合高劑量組 82.39±8.52＊＊##

2.2 Hoechst33258染色結(jié)果顯示 與模型組相比，空白血清組能稍微減少細胞核固縮凝聚，冠心蘇合各劑量組隨著藥物濃度升高細胞核固縮凝聚減輕，碎片依次減少，說明冠心蘇合各劑量組能夠有效的抑制細胞凋亡。

2.3 caspase-3活性的測定結(jié)果 與陰性對照組相比，H2O2處理使得caspase-3活性明顯升高 (P＜0.01);與模型組相比空白血清組變化不大;與模型組及空白血清組相比，caspase-3活性隨含藥血清濃度增高而降低，說明含藥血清能夠阻止caspase-3的激活，結(jié)果如表2。

2.4 Bcl-2及Bax蛋白的表達 Western blot檢測顯示，與陰性對照組相比，H2O2處理使得Bax蛋白表達上調(diào)，Bcl-2蛋白表達下調(diào) (P＜0.01);與模型組相比，冠心蘇合給藥組能夠下調(diào)Bax水平，上調(diào)Bcl-2水平 (P＜0.01)且呈現(xiàn)劑量依賴性(見表3，圖1)。

表2 冠心蘇合含藥血清對H2O2損傷的心肌細胞caspase-3活性的影響(± s，n=6)Tab.2 Effect of Guanxin Suhe-containing serum on caspase-3 activity in primary cultured cardiomyocytes injured by H2O2(± s，n=6)

表2 冠心蘇合含藥血清對H2O2損傷的心肌細胞caspase-3活性的影響(± s，n=6)Tab.2 Effect of Guanxin Suhe-containing serum on caspase-3 activity in primary cultured cardiomyocytes injured by H2O2(± s，n=6)

注:與陰性對照組相比，＊＊P＜0.01;與模型相比，##P＜0.01;與空白血清組相比，▲▲P＜0.01。

組 別 (OD誘導(dǎo)劑/OD陰性對照)/%陰性對照組100.0±0.00模型組 160.8 ±18.1＊＊空白血清組 157.1 ±19.3＊＊##冠心蘇合低劑量組 140.4 ±17.3＊＊##▲▲冠心蘇合中劑量組 124.5 ±9.2＊＊##▲▲冠心蘇合高劑量組 118.9 ±11.6＊＊##▲▲

表3 冠心蘇合含藥血清對H2O2損傷心肌細胞Bax和Bcl-2表達的影響(±s，n=6)Tab.3 Effect of Guanxin Suhe-containing serum on Bcl-2 and Bax expression in primary cultured cardiomyocytes injured by H2O2(±s，n=6)

表3 冠心蘇合含藥血清對H2O2損傷心肌細胞Bax和Bcl-2表達的影響(±s，n=6)Tab.3 Effect of Guanxin Suhe-containing serum on Bcl-2 and Bax expression in primary cultured cardiomyocytes injured by H2O2(±s，n=6)

注:與陰性對照組相比，＊＊P＜0.01;與模型組相比，##P＜0.01;與空白血清組相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

組 別 ABcl-2∶Aβ-actin ABax∶Aβ-actin陰性對照組1.21±0.04 0.73±0.03空白血清組 0.81 ±0.05＊＊## 1.77 ±0.04＊＊##模型組 0.70±0.02＊＊ 1.88±0.01＊＊冠心蘇合低劑量組 0.75±0.04＊＊##▲▲ 1.62±0.02＊＊##▲▲冠心蘇合中劑量組 0.85±0.06＊＊##▲▲ 1.59±0.02＊＊##▲▲冠心蘇合高劑量組 1.07±0.05＊＊##▲▲ 1.37±0.03＊＊##▲▲

圖1 冠心蘇合含藥血清對H2O2損傷心肌細胞中Bax和Bcl-2表達的影響Fig.1 Effect of Guanxin Suhe-containing serum on Bcl-2 and Bax expression in primary cultured cardiomyocytes injured by H2O2

3 討論

冠心蘇合膠囊含有蘇合香、冰片、乳香、檀香、青木香等，具有芳香開竅、理氣止痛的功效［1］，是治療冠心病心絞痛、心肌梗死等疾病的驗方。國內(nèi)學(xué)者［2-4］對此多有研究。但關(guān)于該方是否具有抗心肌細胞凋亡的作用研究鮮有報道。

應(yīng)用血清藥理學(xué)方法其價值在于，一是克服了用中藥制劑直接進行體外實驗時，中藥制劑本身的理化性質(zhì)對實驗的干擾;二是實驗結(jié)果與在體實驗有較好的一致性，不僅能反映中藥母體藥物及其可能的代謝產(chǎn)物的藥理作用，而且還能反映可能藥物誘導(dǎo)機體內(nèi)源性成分所產(chǎn)生的作用，為從細胞分子水平研究中藥藥理學(xué)提供了新的手段［5］。

本實驗采用心肌細胞為研究對象，根據(jù)心臟在氧化損傷過程中氧化增強反應(yīng)的原理，選用H2O2誘導(dǎo)細胞損傷，以模擬細胞病理模型。H2O2濃度在0.1～1 mmol/L范圍內(nèi)就能引起培養(yǎng)的心肌細胞早期的生物化學(xué)改變 (LDH釋放，MDA生成和細胞周期的改變)。采用MTT法觀察冠心蘇合含藥血清對氧化損傷的心肌細胞存活率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，冠心蘇合各劑量組能使損傷心肌細胞的存活率顯著上升，且具有明顯的劑量相關(guān)性，此結(jié)果表明冠心蘇合含藥血清對心肌細胞過氧化損傷存在著明顯的保護作用。

細胞凋亡最突出的特點是細胞凋亡起始于細胞核的改變，細胞核凋亡小體的形成即是細胞凋亡的主要形態(tài)學(xué)特征。本實驗將不同濃度冠心蘇合含藥血清作用于H2O2損傷后的原代心肌細胞后，經(jīng)Hoechst 33258染色后發(fā)現(xiàn):H2O2損傷模型組可見到明顯的凋亡細胞特征——細胞膜完整，細胞染色質(zhì)斷裂聚集，固縮，可見到凋亡小體，符從冠心蘇合各劑量組凋亡小體隨濃度增加而減少。

Bcl-2家族是調(diào)控細胞凋亡的基因家族中最受重視的，分為抑凋亡基因和促凋亡基因兩類?；蜣D(zhuǎn)染的實驗已證實，Bcl-2蛋白能阻止并能消除多因素介導(dǎo)的凋亡，說明Bcl-2基因處于凋亡調(diào)控的終末部分，其表達狀態(tài)可決定細胞的生存與死亡。Bax可誘導(dǎo)細胞色素C的釋放，激活caspase-3蛋白酶，引起細胞凋亡。細胞內(nèi)Bax與Bcl-2的比例調(diào)節(jié)了凋亡的發(fā)生［7-8］。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，冠心蘇合各劑量組可使模型損傷組細胞中Bcl-2水平上調(diào)，Bax水平下降，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。由此可推測，冠心蘇合含藥血清可能是通過上調(diào)Bcl-2與Bax的比值，使Bax/Bax同二聚體減少對細胞凋亡起到抑制作用的。

在caspase家族成員中，caspase-3被認為是各種凋亡刺激因子激活的關(guān)鍵蛋白酶，是細胞凋亡下游的主要和關(guān)鍵執(zhí)行者，是凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路［9-10］。本實驗用不同濃度冠心蘇合含藥血清處理H2O2損傷后的心肌細胞后發(fā)現(xiàn)，冠心蘇合含藥血清可阻止caspase-3途徑的激活，且呈一定劑量依賴性。

此外，CytoC、p-AKT/AKT、pERK/ERK等蛋白也可以從不同的通路驗證凋亡的發(fā)生。硫氧還蛋白 (TRX)為細胞內(nèi)重要的氧化還原調(diào)節(jié)分子之一［11］，細胞缺氧時，TRX發(fā)生從胞漿到胞核的轉(zhuǎn)位，故檢測細胞裂解后懸液中TRX的表達也是探討藥物作用機制很好的指標。近年來文獻資料顯示，熱休克蛋白家族在心肌缺血再灌注損傷中有良好的保護作用，可明顯提高心肌細胞對缺血的耐受性，減少了心肌梗死的面積［12］。

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