宗俊青 馬 捷

1.山西醫(yī)科大學(xué)，山西太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心胸外科，山西太原 030001

氯化血紅素對(duì)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

宗俊青1馬 捷2▲

1.山西醫(yī)科大學(xué)，山西太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心胸外科，山西太原 030001

目的 探討氯化血紅素（hemin）對(duì)過(guò)氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（PMVECs）氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。 方法①應(yīng)用SD雄性大鼠的肺組織，進(jìn)行大鼠PMVECs的原代培養(yǎng)并傳代培養(yǎng)；通過(guò)倒置顯微鏡觀察其形態(tài)，Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫熒光鑒定。②應(yīng)用H2O2構(gòu)建PMVECs氧化應(yīng)激損傷模型，并用hemin與H2O2共同孵育PMVECs。③采用MTT比色法檢測(cè)各組細(xì)胞活力變化，用比色法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液中乳酸脫氫酶（LDH）的含量，Western-blot檢測(cè)各組內(nèi)皮細(xì)胞微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC-3）含量。 結(jié)果 ①體外培養(yǎng)的大鼠PMVECs呈梭形或多角形，形成單層后呈典型的鵝卵石樣或鋪路石樣排列，免疫熒光檢測(cè)FITC標(biāo)記的Ⅷ相關(guān)抗體呈陽(yáng)性，陽(yáng)性率90%以上，成功建立了PMVECs的原代培養(yǎng)方法；②H2O2使內(nèi)皮細(xì)胞活力下降，且呈劑量依賴性，200 μmol/L H2O2內(nèi)皮細(xì)胞活力下降50%左右；③H2O2組LDH含量均高于hemin組及正常對(duì)照組（P＜0.05），hemin組LC-3的表達(dá)顯著低于H2O2組。 結(jié)論 低濃度hemin對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PMVECs氧化應(yīng)激損傷有保護(hù)作用，這種作用可能與hemin抑制H2O2誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)度自噬有關(guān)。

氯化血紅素；肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞；過(guò)氧化氫；自噬

肺損傷常發(fā)生在體外循環(huán)、心肺聯(lián)合移植、肺切除、肺栓塞、復(fù)張性肺水腫、休克及心肺復(fù)蘇等多種臨床情況下。在各種原因引起的肺損傷中，肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（pulmonary microvascular endothelial cells，PMVECs）是活性氧類的重要靶細(xì)胞之一。PMVECs構(gòu)成半選擇性屏障，該屏障對(duì)于肺氣體交換，調(diào)節(jié)液體和可溶物在血液與肺間質(zhì)之間的流動(dòng)具有重要意義。雖然肺微血管內(nèi)皮和肺大血管內(nèi)皮之間有一定相似的功能和表型，但是并不完全相同。文獻(xiàn)報(bào)道微血管和大血管表型和功能有顯著不同[1]。因此，發(fā)現(xiàn)和探討一種新的保護(hù)PMVECs的方法，對(duì)治療內(nèi)皮損傷以及由此引發(fā)的各種疾病具有重要意義。研究經(jīng)證實(shí)低濃度的氯化血紅素（hemin）可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生血紅素氧合酶，從而起到抗氧化損傷及抗凋亡的作用。

近年來(lái)自噬（autophagy）的研究不斷升溫且研究也在逐漸深入。自噬是細(xì)胞將受損、變性的蛋白質(zhì)以及損傷細(xì)胞器運(yùn)輸?shù)饺苊阁w進(jìn)行消化降解，以胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)自噬體為特征的細(xì)胞自我消化過(guò)程，是細(xì)胞應(yīng)激情況下用來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和存活的重要機(jī)制[2-3]，同時(shí)過(guò)度的自噬也會(huì)對(duì)細(xì)胞有損傷作用最終使細(xì)胞凋亡。因此，對(duì)影響血管內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)度自噬相關(guān)因素的了解及其相關(guān)機(jī)制的研究，對(duì)維持血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活及功能有重要的作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠PMVECs體外培養(yǎng)模型，觀察H2O2在RPMVECs氧化應(yīng)激損傷中的作用及hemin的保護(hù)作用，并對(duì)其自噬水平進(jìn)行了初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

內(nèi)皮細(xì)胞特制培養(yǎng)體系（含500 ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基，25 ml胎牛血清及5ml內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加物和5 ml青霉素/鏈霉素）購(gòu)于ScienCell公司；兔抗鼠Ⅷ相關(guān)抗原購(gòu)于北京中杉金橋公司；低糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于Hyclone公司；FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)于北京博奧森公司；特級(jí)胎牛血清購(gòu)于GIBCO公司；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒為碧云天產(chǎn)品；二甲基亞砜（DMSO）、氯化高鐵血紅素購(gòu)于Sigma公司；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG和兔抗鼠β-actin抗體購(gòu)于中杉金橋公司；兔抗鼠內(nèi)皮細(xì)胞微管相關(guān)蛋白1輕鏈 3（LC-3）B 抗體購(gòu)于 Cell Signaling Technology（CST）公司。

1.2 內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定

選重150～200 g健康SD雄性大鼠。10%的水合氯醛腹腔注射麻醉。將整個(gè)大鼠泡于75%的乙醇中5～10 s，在超凈工作臺(tái)上，剪下心肺組織放入盛有含青霉素和鏈霉素各100 U/ml的D-Hanks中沖洗。洗凈血跡。用眼科剪盡量剪去肺臟表面的臟層胸膜。剪成1 mm3大小的組織塊。將剪好的組織塊接種于25 cm2的無(wú)菌培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶倒置放入培養(yǎng)箱中，干貼壁2 h左右后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶加入約3 ml含20%血清的完全培養(yǎng)液。培養(yǎng)12～16 h時(shí)輕輕換液，以去除血細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)約40 h后取出組織塊，同時(shí)換液，繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d待細(xì)胞融合成單層約80%時(shí)傳代。取用3～4代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。內(nèi)皮細(xì)胞鑒定采用免疫熒光法鑒定，抗體為兔抗鼠Ⅷ因子一抗和FITC羊抗兔二抗對(duì)細(xì)胞鑒定。

1.3 MTT法測(cè)定H2O2對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷

實(shí)驗(yàn)分 5 組（對(duì)照組，H2O2100 μmol/L 組，H2O2200 μmol/L組，H2O2500 μmol/L 組，H2O2800 μmol/L 組），每組 6 個(gè)復(fù)孔，各組都孵育4 h后，棄去原培養(yǎng)基，每孔加入5 mg/ml的MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，吸出原液。 加入 100 μl的 DMSO原液，振蕩10 min，待結(jié)晶完全溶解后用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值（OD值），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 乳酸脫氫酶的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)分 5 組（對(duì)照組，200 μmol/L H2O2組，2.5 μmol/L hemin+200 μmol/L H2O2組 ，5 μmol/L hemin+200 μmol/L H2O2組，10 μmol/L hemin+200 μmol/L H2O2組）取 2～4 代生長(zhǎng)良好的內(nèi)皮細(xì)胞，同步化12 h后。取上清液，按乳酸脫氫酶測(cè)試盒的方法測(cè)定培養(yǎng)液中的LDH釋放量。

1.5 細(xì)胞LC-3表達(dá)水平的測(cè)定

分組及處理同前，Western-blot測(cè)定各組細(xì)胞LC-3蛋白表達(dá)情況。提取各組細(xì)胞中的總蛋白，調(diào)整上樣量100 μg/孔，用5%濃縮膠和12%的分離膠電泳分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%的脫脂奶粉封閉后依次加入兔抗鼠 LC-3B 抗體（1∶1000）和兔抗鼠 β-actin 抗體（1∶1000）。4℃過(guò)夜，洗滌后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗（1∶2500），洗膜后超敏發(fā)光液顯色。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺微血管內(nèi)皮原代細(xì)胞的鑒定

倒置相差顯微鏡下觀察肺組織塊貼于培養(yǎng)瓶壁后，血細(xì)胞立即從肺組織塊邊緣向四周游出，24 h左右PMVECs游出，60 h左右去掉組織塊可以獲得只有少量血細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的混合物。原代細(xì)胞生長(zhǎng)3～6 d后可融合形成細(xì)胞單層，細(xì)胞呈鵝卵石鑲嵌狀排列（圖1），再培養(yǎng)3 d時(shí)見(jiàn)有血管腔樣結(jié)構(gòu)形成（圖2）。

圖1 大鼠PMVECs去除組織塊第5天（×100）

圖2 再培養(yǎng)3 d時(shí)見(jiàn)有血管腔樣結(jié)構(gòu)形成（×200）

2.2 免疫熒光鑒定

Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫熒光染色后細(xì)胞漿內(nèi)有綠色熒光，證實(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞（圖3）。

圖3 第3代肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫熒光染色陽(yáng)性（×200）

2.3 內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的比較

MTT測(cè)定半數(shù)抑制率，細(xì)胞抑制率隨H2O2濃度增大而增大（測(cè)3次取平均值）（表1）。

表1 內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的比較（%，±s）

表1 內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的比較（%，±s）

選取200 μmol/l H2O2作后續(xù)實(shí)驗(yàn)

組別抑制率100 μmol/L H2O2 組200 μmol/L H2O2 組500 μmol/L H2O2 組800 μmol/L H2O2 組34.0±7.2 49.0±8.4 73.0±11.7 80.0±8.2

2.4 各組內(nèi)皮細(xì)胞LDH的比較

H2O2組LDH釋放量較正常組明顯升高（P<0.05），經(jīng)hemin處理后的內(nèi)皮細(xì)胞LDH釋放量明顯低于H2O2組（P<0.05）（表 2）。

表2 各組內(nèi)皮細(xì)胞LDH的比較（U/L，±s）

表2 各組內(nèi)皮細(xì)胞LDH的比較（U/L，±s）

與對(duì)照組比較，#P<0.05，與 200 μmol/L H2O2組比較，*P<0.05

組別LDH對(duì)照組200 μmol/L H2O2 組200 μmol/L H2O2+2.5 μmol/L hemin 組200 μmol/L H2O2+5 μmol/L hemin 組200 μmol/L H2O2+10 μmol/L hemin 組71.31±11.54*516.45±20.59#446.77±26.19#*361.69±27.12#*307.14±17.35#*

2.5 Western-blot檢測(cè)細(xì)胞LC-3蛋白的表達(dá)

H2O2組LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組（P<0.05），經(jīng)各濃度hemin組處理的內(nèi)皮細(xì)胞蛋白LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ的量明顯低于H2O2組，且有一定的劑量依賴性（P<0.05）。5，10 μmol/L hemin 組 LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ表達(dá)量明顯低于2.5 μmol/L 組（P<0.05）（圖 4、表 3）。

圖4 Western-blot檢測(cè)細(xì)胞LC-3蛋白表達(dá)結(jié)果

表3 各組LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ蛋白表達(dá)情況的比較

3 討論

目前，用于血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)的方法主要有酶消化法、組織塊法、機(jī)械刮取法等，其中酶消化法主要用于大血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)且常混有成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等雜細(xì)胞[4]。組織塊種植法培養(yǎng)大鼠PMVECs，因其簡(jiǎn)便、高效而在國(guó)內(nèi)應(yīng)用較廣。本研究采用大鼠肺組織貼塊法成功地培養(yǎng)出PMVECs。通過(guò)應(yīng)用內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基和加用肝素使內(nèi)皮細(xì)胞純化，差速消化法等措施來(lái)防止雜細(xì)胞的污染。此法能避免機(jī)械損傷和化學(xué)損傷，且不需特殊設(shè)備，操作簡(jiǎn)單。研究結(jié)果顯示培養(yǎng)5～7 d內(nèi)皮細(xì)胞可達(dá)一定的細(xì)胞密度，融合成片狀，這與相關(guān)文獻(xiàn)[5-6]報(bào)道一致。通過(guò)組織塊的來(lái)源，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況、細(xì)胞形態(tài)以及免疫熒光鑒定證實(shí)，培養(yǎng)獲得的細(xì)胞為大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞。

自噬是指細(xì)胞內(nèi)受損、變性或衰老的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器被運(yùn)輸?shù)饺苊阁w，溶酶體對(duì)其消化降解的過(guò)程。Ashford等[7]在小鼠肝細(xì)胞中觀察到細(xì)胞自噬現(xiàn)象。通常情況下細(xì)胞保持著輕度自噬以保持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，維持生存；但過(guò)度自噬會(huì)破會(huì)這種平衡使細(xì)胞死亡[8]。同時(shí)凋亡和自噬保持著動(dòng)態(tài)平衡，即自噬可能為凋亡所需，自噬通常先于凋亡，進(jìn)而啟動(dòng)凋亡；自噬亦可能抑制凋亡作用，可保護(hù)細(xì)胞免于發(fā)生凋亡和壞死；自噬還可能向凋亡轉(zhuǎn)化，共同促進(jìn)細(xì)胞死亡；以上都說(shuō)明自噬與細(xì)胞生存有密切聯(lián)系。最近研究發(fā)現(xiàn)自噬在肺動(dòng)脈高壓及乳腺癌中也起著重要作用[9-10]，同時(shí)越來(lái)越多的研究證實(shí)自噬在許多疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。

自噬形成過(guò)程中，多種自噬相關(guān)基因（ATG）參與自噬泡的形成，而LC-3修飾過(guò)程對(duì)自噬泡的形成必不可少，均與自噬泡的形成息息相關(guān)。而LC-3Ⅱ是自噬體的標(biāo)志分子。所以本實(shí)驗(yàn)把LC-3Ⅱ作為評(píng)價(jià)自噬水平的標(biāo)志分子。

hemin屬于血紅素的一種，目前發(fā)現(xiàn)其具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)hemin可以降低原發(fā)性高血壓大鼠的血壓[11]，也可以減輕由于缺氧導(dǎo)致的肺動(dòng)脈高壓[12]。Togane[13]等人發(fā)現(xiàn)hemin可以對(duì)抗球囊損傷模型對(duì)血管平滑肌的損傷。hemin對(duì)血管系統(tǒng)的保護(hù)作用機(jī)制未明確，可能與其誘導(dǎo)HO-1的合成有關(guān)。HO-1可以明顯的抑制炎癥因子MMP-9、IL-6和TNF-α等的表達(dá)。HO-1的抗炎作用很大程度上是由HO-1分解血紅素的產(chǎn)物一氧化碳介導(dǎo)的[14]。但是，其對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷的內(nèi)皮細(xì)胞是否具有保護(hù)作用以及對(duì)細(xì)胞自噬水平的影響并不完全清楚。

H2O2能夠穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，從而造成DNA鏈斷裂，導(dǎo)致細(xì)胞損傷以及使細(xì)胞凋亡[15]，過(guò)度的H2O2能誘導(dǎo)自噬性細(xì)胞死亡，H2O2誘導(dǎo)的自噬性細(xì)胞存活和死亡之間的關(guān)系仍待于進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)中H2O2損傷組中LDH及LC3-Ⅱ含量均明顯升高，表明H2O2有引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷，抑制細(xì)胞的增殖代償?shù)哪芰?。同時(shí)可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞提高自噬活性。而用低濃度hemin處理可降低其LDH及LC-3Ⅱ含量，表明hemin可明顯減輕 H2O2引起的活性氧簇，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷有保護(hù)作用，而這種保護(hù)作用可能是與hemin抑制了內(nèi)皮細(xì)胞的過(guò)度自噬有關(guān)。

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The protective effects of hemin against H2O2-induced rat pulmonary microvascular endothelial cells injury

ZONG Jun-qing1MA Jie2▲

1.Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China;2.Department of Cardiothoracic Surgery,the Second Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China.

ObjectiveTo study the protective effects of hemin against H2O2-induced rat pulmonary microvascular endothelial cells(PMVECs)oxidative stress injury.Methods①The modified tissue block pasted culture method was used to isolate and culture male Sprague-Dawley rat PMVECs.The morphous of cultured cells were observed by microscopy.The cultured cells were identified by immunofluorescence staining of factorⅧ related antigen.②To establish the rat PMVECs oxidative stress injury modle by H2O2treatment.Rat PMVECs were incubated with hemin and H2O2.③cell viability was detected by MTT assay.Levels of lactate dehydrogenase(LDH)were measured by supernatant,western-blot was used to evaluate LC-3 protein expression.Results①The cultured PMVECs of rat in vitro showed fusiform shape or polygon,and the monolayer cultures displayed a typical cobblestone or paving-stone morphology,the PMVECs expressed factorⅧ associated antigen.②The viability of PMVEC could be reduce H2O2significantly in dose dependent manners,and reduced to 50%when treated with 200 μmol/L H2O2.③LDH content in H2O2group were higher than that of hemin group and normal control group(P<0.05),the expression of hemin group of LC-3 significantly lower than that of H2O2group Conclusion Hemin treatment can protect against H2O2induced injuries and this protection effects maybe relate to hemin reducing the endothelial cells excess autophagy.

Hemin;Pulmonary microvascular endothelial cells;H2O2;Autophagy

R-332

A

1674-4721（2013）08（c）-0006-04

宗俊青（1984-），性別：男；學(xué)歷：碩士研究生；研究方向：心肺保護(hù)

▲通訊作者：馬捷（1957-），性別：男；職稱：博士生導(dǎo)師；研究方向：微創(chuàng)心臟外科學(xué)

2013-04-10 本文編輯：魏玉坡）