金莉莎 劉仲華， 黃建安 蔡淑嫻

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128；2.國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410128）

古醫(yī)書中早有記載茶葉對腸道疾病的預(yù)防和治療作用［1］?，F(xiàn)代茶醫(yī)學(xué)研究［2，3］表明，茶葉具有改善腸道菌群、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等多種保健養(yǎng)生功效。盡管不同茶類可能具有同一保健養(yǎng)生功能，但由于原料和加工工藝不同，品質(zhì)風(fēng)味與內(nèi)含物質(zhì)組成不同，其產(chǎn)生某一作用的效能及作用途徑可能存在一定差異。大紅袍是閩北烏龍茶的極品，屬于半發(fā)酵茶，紅茶是多酚氧化酶主導(dǎo)下的全發(fā)酵茶，長期的民間飲用實踐表明，大紅袍和工夫紅茶都有一定的調(diào)理腸胃作用，但對它們的作用效果及作用途徑尚缺乏深入的研究［4］。本試驗采用大紅袍和紅茶提取凍干粉飼喂試驗小鼠，然后利用抗生素類藥物鹽酸林可霉素誘導(dǎo)試驗小鼠腸道菌群失衡及機(jī)體免疫功能紊亂，探討茶葉對腸道菌群及機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)效果，為大紅袍和紅茶的保健養(yǎng)生消費提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 儀器與試劑

全自動生化分析儀：LABOSPECT003型，日本日立公司；

臺式冷凍離心機(jī)：MIKRO 22R型，德國Hettich公司；

石蠟切片機(jī)：Leica RM2235型，德國徠卡公司；

生物顯微鏡：Leica DM2000型，德國徠卡公司；

酶 標(biāo) 儀：Thermo Scientific Varioskan Flash 型，美 國Thermo公司；

冷凍干燥機(jī)：Modulyod－230型，美國 Thermo Fisher scientific公司；

旋轉(zhuǎn)濃縮蒸發(fā)儀：BUCHI R－200型，瑞士BUCHI公司；

血清總蛋白（TP）、白蛋白（Alb）測定試劑盒：上?？迫A生物科技有限公司；

血清IgG ELISA測定試劑盒：美國Cusabio公司；

鹽酸林可霉素：300mg／mL，批號：H41020128，河南天方藥業(yè)股份有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

BBL培養(yǎng)基（培養(yǎng)雙歧桿菌）、MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基（培養(yǎng)乳桿菌）、EC瓊脂培養(yǎng)基（培養(yǎng)腸球菌）及EMB培養(yǎng)基（培養(yǎng)腸桿菌）：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.3 供試材料

大紅袍：老記大紅袍，中國老記茶業(yè)集團(tuán)；

紅茶：文新信陽紅（條形工夫紅茶），河南省信陽文新茶葉有限公司。

1.1.4 試驗動物及基礎(chǔ)飼料

昆明小鼠：SPF級，雄性，體重20～25g，湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司。試驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2011－0003。

動物基礎(chǔ)飼料：湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組、造模

（1）茶葉水提物的制備：試驗時，沸水浸泡30min（1∶10（m∶V）茶水比），冷卻后過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后于冷凍干燥機(jī)中凍干。收集凍干茶粉，密封保存?zhèn)溆?。兩種茶葉水提物的主要品質(zhì)成分含量見表1。

表1 茶葉水提物的主要品質(zhì)成分含量Table 1 The content of main components of different tea extracts

（2）劑量配置：試驗所選高、低劑量濃度分別為300，75mg／kg。每只小鼠的灌胃體積為0.3mL／d。

（3）試驗動物組別設(shè)計：所有小鼠自由攝食、飲水，飼喂基礎(chǔ)飼料，環(huán)境相對濕度控制在45%～60%，溫度（20±5）℃。喂養(yǎng)3d讓其適應(yīng)飼喂方式與環(huán)境，3d后隨機(jī)分為6組，每組10只小鼠，分別為正常對照組、模型對照組、大紅袍低劑量組、大紅袍高劑量組、紅茶低劑量組、紅茶高劑量組。開始8d，正常對照組和模型對照組灌胃生理鹽水，其他4組分別灌胃相應(yīng)的受試樣品。第9天，茶葉4組除灌胃相應(yīng)的受試物外，與模型組一起灌胃300mg／mL鹽酸林可霉素，0.3mL每次，每天2次，正常對照組則灌胃等量生理鹽水，連續(xù)5d，于最后1次給受試物24h后，無菌采集小鼠鮮糞便檢測腸道菌群數(shù)量。試驗結(jié)束后，處死小鼠。

1.2.2 腸道菌群檢測 根據(jù)文獻(xiàn)［5］，修改如下：用已滅菌的瓶子無菌采集小鼠鮮糞便，加無菌水遞10倍稀釋至10－8，在超凈工作臺上取1mL分別接種在各類培養(yǎng)基上，EC培養(yǎng)基、EMB培養(yǎng)基放入需氧培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，BBL培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。菌落長出后計數(shù)并計算每克糞便中各菌群的菌落形成單位（CFU／g）。

1.2.3 脾指數(shù)測定 小鼠處死前稱量體重，處死后分離脾臟，稱量脾臟重量。按式（1）計算脾指數(shù)。

1.2.4 血清中各指標(biāo)的測定 血清總蛋白（TP）、白蛋白（Alb）在全自動生化分析儀上進(jìn)行檢測，根據(jù)總蛋白、白蛋白的含量計算出血清球蛋白的含量。血清IgG含量按照ELISA試劑盒要求進(jìn)行測定。

1.2.5 病理學(xué)檢測 取小鼠結(jié)腸組織，HE染色，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠腸道菌群失調(diào)模型驗證

模型組灌胃鹽酸林可霉素5d后，小鼠行動緩慢、背毛豎起并出現(xiàn)腹瀉的癥狀，立即采取鮮糞便進(jìn)行菌落計數(shù)及統(tǒng)計分析（表2）。結(jié)果表明，模型對照組的腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌、乳桿菌與正常對照組相比，有不同程度的減少，且存在著極顯著差異（P＜0.01）。解剖正常對照組和模型對照組小鼠，發(fā)現(xiàn)模型對照組小鼠盲腸充血腫脹，腸壁變薄，內(nèi)容物呈水狀，上述結(jié)果證實通過灌胃鹽酸林可霉素，成功建立了菌群失衡模型。

2.2 大紅袍和紅茶對鹽酸林可霉素誘導(dǎo)小鼠腸道菌群失衡的影響

在小鼠灌胃鹽酸林可霉素5d后，大紅袍2個劑量組的菌群菌量與模型對照組小鼠相比存在極顯著差異（P＜0.01），接近正常對照組的水平；紅茶只有在高劑量時，腸球菌、雙歧桿菌和乳桿菌菌群菌量與模型對照組小鼠相比有顯著差異（P＜0.05）。由此可見，大紅袍和紅茶在預(yù)防抗生素所致的腸道菌群紊亂方面具有一定的作用，且大紅袍的預(yù)防效果優(yōu)于紅茶（表2）。

2.3 大紅袍和紅茶對試驗小鼠脾指數(shù)、球蛋白和IgG的影響

脾指數(shù)、球蛋白含量和免疫球蛋白IgG含量是反映小鼠機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo)。由表3可知，大紅袍2個劑量組和紅茶2個劑量組的脾指數(shù)均高于模型對照組，但無統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異。大紅袍2個劑量組和紅茶2個劑量組的球蛋白含量與模型對照組相比均明顯增加，且大紅袍、紅茶低劑量組與模型對照組有顯著差異（P＜0.05），大紅袍、紅茶高劑量組與模型對照組存在極顯著差異（P＜0.01）。大紅袍2個劑量組和紅茶2個劑量組的免疫球蛋白IgG含量均明顯高于模型組，且均存在極顯著差異（P＜0.01）。

表2 小鼠經(jīng)鹽酸林可霉素灌胃后腸道菌群的變化?Table 2 Change of intestinal flora in mice after feeding lincomycin hydrochloride ／（lg N·g－1）

表3 小鼠經(jīng)鹽酸林可霉素灌胃后脾指數(shù)、球蛋白和IgG的變化?Table 3 Change of spleen index，globulin and IgG in mice after feeding lincomycin hydrochloride

2.4 各組小鼠結(jié)腸切片的病理觀察

由圖1可知，正常小鼠結(jié)腸組織表面光滑，小腸絨毛粗大，腸黏膜上皮完整；模型組小鼠小腸絨毛充血、水腫，腸絨毛變平、變短、萎縮、倒伏，小腸絨毛輪廓不清，部分腺上皮脫落，可見炎性細(xì)胞浸潤；大紅袍低劑量組小鼠腸黏膜較完整，

圖1 各組小鼠結(jié)腸切片圖（100×）Figure 1 Colon section of mice in different groups（100×）

小腸絨毛變短，可見少量炎性細(xì)胞浸潤；大紅袍高劑量組小鼠結(jié)腸組織表面光滑，潰瘍面恢復(fù)較好，小腸絨毛變長；紅茶低劑量組小鼠腸絨毛變短、萎縮、輪廓不清，可見炎性細(xì)胞浸潤；紅茶高劑量組小鼠腸黏膜較完整，腸絨毛輪廓較清晰。從小鼠結(jié)腸切片可以清晰地看出，大紅袍和紅茶對抗生素藥物鹽酸林可霉素誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸組織病變均具有一定的預(yù)防作用，且高劑量較低劑量效果明顯，同一劑量條件下，大紅袍比紅茶的效果要好一些。

3 討論

石梅等［6］用抗生素混合液灌胃小鼠連續(xù)3d，小鼠腸道菌群失衡，脾指數(shù)、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率及血清免疫球蛋白IgG含量等均明顯下降。劉崇海等［7］給小鼠口服抗生素后給予白色念珠菌，使其腸道菌群失衡后發(fā)現(xiàn)PHA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、脾指數(shù)以及TLR2和TLR4基因表達(dá)水平與正常組相比均降低。這些均表明抗生素誘導(dǎo)的動物腸道菌群失衡可致機(jī)體免疫功能紊亂或低下。

本試驗采用鹽酸林可霉素誘導(dǎo)小鼠腸道菌群失衡，模型組小鼠表現(xiàn)出腸桿菌、腸球菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌菌量大幅度減少，脾指數(shù)、血清球蛋白含量、免疫球蛋白IgG含量均下降，腸絨毛損傷嚴(yán)重。然而，使用大紅袍和紅茶提取物飼喂預(yù)防后，尤其是高劑量使用后，這種由鹽酸林可霉素引起的小鼠腸道菌落失衡、機(jī)體免疫功能紊亂及結(jié)腸組織病變等現(xiàn)象得到明顯抑制。這說明在使用抗生素的同時飲用大紅袍和紅茶，對預(yù)防腸道菌群失衡和機(jī)體免疫功能紊亂方面具有一定的作用，且在等劑量條件下大紅袍的效果優(yōu)于紅茶。從表1大紅袍和紅茶水提物的主要品質(zhì)成分含量中，可以看出大紅袍的茶多酚和茶多糖含量均高于紅茶，且有研究［8］表明，茶多酚能提高小鼠腸道中的雙歧桿菌含量，所以大紅袍預(yù)防腸道菌群失衡的效果優(yōu)于紅茶可能與這些成分有關(guān)，但其作用機(jī)理還需進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

1 陳宗懋.茶對人體腸道免疫功能的影響［J］.中國茶葉，1995（5）：26～27.

2 Wolfram S，Wang Y，Thieleeke F.Anti－obesity effects of green tea：From bedside to bench［J］.Mol Nutr Food Res，2006，50（2）：176～187.

3 Kao Y H，Chang H，Lee M J.Tea，obesity，and diabetes［J］.Mol Nutr Food Res，2006，50（21）：188～210.

4 徐仲溪，王坤波.茶多糖化學(xué)及生物活性研究［J］.茶葉科學(xué)，2004，24（2）：75～81.

5 張燕，羅予.加味四君子湯對小鼠腸道免疫功能調(diào)整作用的研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2010，21（5）：1 181～1 183.

6 石梅，彭廣能，鐘志軍，等.思密達(dá)對實驗性小鼠腸道菌群及免疫功能影響的研究［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2007（11）：88～89.

7 劉崇海，楊錫強(qiáng)，劉恩梅，等.抗生素誘導(dǎo)小鼠腸道菌群失調(diào)對免疫功能和Toll樣受體2、4基因表達(dá)的影響［J］.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2007，32（8）：839～842.

8 王瑋，曾本華，李桂花，等.茶多酚對apoE－／－－小鼠脂類代謝和腸道雙歧桿菌的影響［J］.食品與機(jī)械，2012，28（4）：106～109.