張 康，龔振華，劉 坤，王麗萍，劉國(guó)慶，李 蕾，張麗娟，侯廣宇，張秀娟，單 虎

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島 266109；2.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032 ；3.黃島動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，山東青島 266000 ； 4.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，甘肅蘭州 730070）

禽腫瘤病主要包括馬立克氏?。∕D）、禽白血?。ˋL）、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥（RE）等，其主要特征是可引起家禽腫瘤性死亡和生產(chǎn)性能下降。雞群一旦發(fā)生這些腫瘤病，造成的經(jīng)濟(jì)損失相當(dāng)嚴(yán)重。這三種腫瘤性疾病在世界各地均流行，尤其是近年來(lái)免疫失敗和強(qiáng)毒力致病型的毒株不斷增多，給目前的養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)巨大的損失[1，2，3]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外采用PCR方法檢測(cè)雞馬立克氏病、禽白血病、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥取得了一定的進(jìn)展[4-6]，對(duì)預(yù)防和控制禽腫瘤病起到一定的作用。我們采用PCR方法對(duì)RE、MD、AL進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查，了解華東北部地區(qū)的禽腫瘤病流行狀況， 從而為家禽腫瘤性疾病防制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 引物

用于檢測(cè)馬立克氏病、禽白血病、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥的引物參考Gong Z等合成的引物[7]，引物的詳細(xì)資料見表1。

表1 檢測(cè)馬立克氏病、禽白血病、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥的引物

1.2 試驗(yàn)樣品

采集無(wú)癥狀雞血液樣本 600 份，其中瑯琊蛋雞120份、海蘭雞180份、AA肉雞140份、艾維茵雞160份；采集有癥狀雞肝臟組織樣品200份。這些樣品均用于檢測(cè)馬立克氏病、禽白血病、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥。

1.3 試劑

DNA純化試劑盒、Taq DNA聚合酶消瘦、衰竭；進(jìn)一步剖檢觀察病理變化，可見有癥狀雞內(nèi)臟器官普遍腫大，肝、脾、腎表面及切面有大小不等的灰白色腫瘤樣結(jié)節(jié)，觀察發(fā)現(xiàn)腫瘤發(fā)生的部位主要在肝臟，其次依次為脾臟、腺胃、腎。

3.2 用PCR方法對(duì)600份健康雞全血進(jìn)行檢測(cè)，檢出馬立克氏病陽(yáng)性雞23只，其中瑯琊蛋雞的陽(yáng)性率最低，為3.3%，海蘭雞的陽(yáng)性率最高，為4.4%。檢查200份有癥狀雞，馬立克氏病病死雞為148只，其中海蘭雞病死率最高，為78.3%，艾維茵雞病死率最低，為70.9%（表2）。

表2 MD的調(diào)查結(jié)果

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品處理

肝臟組織樣品：取肝臟組織樣品研磨成勻漿，加入無(wú)菌的PBS，離心取上清液，用 DNA純化試劑盒純化DNA。首先用蛋白酶處理樣品上清，加入等體積的無(wú)水乙醇，用微型離心層析柱離心，沖洗后回收純化的DNA。血液樣品DNA純化與此相同。

2.2 樣品檢測(cè)

將采集的600份無(wú)癥狀雞全血樣品以及200份有癥狀雞肝組織樣品提取DNA后，進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測(cè)馬立克氏病、禽白血病、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒核酸。先95℃ 5 min使模板充分變性，然后94℃1min變性、53℃ 1min退火、72℃ 2min 延伸，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃ 10 min使產(chǎn)物延伸完整。

3.3 用PCR方法對(duì)600份健康雞全血進(jìn)行檢測(cè)，檢出禽白血病陽(yáng)性雞58只，其中海蘭雞的陽(yáng)性率最低，為 8.3%，瑯琊蛋雞的陽(yáng)性率最高，為11.6%。檢查200份有癥狀雞，禽白血病病死雞為11只，其中海蘭雞病死率最高，為6.6%，AA肉雞病死率最低，為4.4%（表3）。

表3 AL的調(diào)查結(jié)果

3 結(jié)果

3.1 疑似感染禽腫瘤病的雞冠蒼白皺縮、發(fā)紺、

3.4 用PCR方法對(duì)600份健康雞全血進(jìn)行檢測(cè)，檢出禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥陽(yáng)性雞11只，其中艾維茵雞的陽(yáng)性率最低，為4.3%，海蘭雞的陽(yáng)性率最高，為5.5%。檢查200份有癥狀雞，禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病死雞為11只，其中AA肉雞病死率最低，為4.4%，海蘭雞病死率最高，為6.7%（表4）。

表4 RE的調(diào)查結(jié)果

4 討論與分析

4.1 馬立克病雞大部分終生帶毒，病毒不斷從脫落的羽毛囊皮屑中排出有傳染性的MDV，這就是MD的傳播難于控制根本原因。出現(xiàn)臨診癥狀的病雞有少部分能康復(fù)，但多數(shù)以死 亡告終，且多發(fā)生于肉雞和飼養(yǎng)密度較大的雞場(chǎng)，沒有明顯的季節(jié)性，多發(fā)于冬春[8]。本次調(diào)查對(duì)MD的患雞和死雞進(jìn)行剖檢后發(fā)現(xiàn)，病死雞主要表現(xiàn)為內(nèi)臟型病變。200份有癥狀雞中，MD病死雞為148只，其中海蘭雞病死率最高，為78.3%，艾維茵雞病死率最低，為70.9%。600份無(wú)癥狀雞中瑯琊蛋雞的陽(yáng)性率最低，為3.3%，海蘭雞的陽(yáng)性率最高，為4.4%。雞群在接種疫苗之后，發(fā)病率明顯地降低，很大程度地減少了損失，但一些雞群仍然存在馬立克氏病毒感染，造成不同程度的損失。由此可見，應(yīng)加強(qiáng)MD疫苗免疫，減少病原，減輕危害。

4.2 禽白血病主要引起雞死亡或消瘦、生長(zhǎng)和發(fā)育不良，同時(shí)引起機(jī)體抵抗力下降和免疫抑制，成為危害養(yǎng)禽業(yè)的主要疾病之一，目前還沒有合適的疫苗和有效的藥物可預(yù)防和治療這種疾病[8]。本次調(diào)查對(duì)600份無(wú)癥狀雞全血進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)禽白血病陽(yáng)性雞58只，其中海蘭雞的陽(yáng)性率最低，為8.3%，瑯琊蛋雞的陽(yáng)性率最高，為11.6%。檢查200份有癥狀雞，禽白血病病死雞為11只，其中海蘭雞病死率最高，為6.6%，AA肉雞病死率最低，為4.4%。由此可見，禽白血病在臨床上感染率較高，應(yīng)重視種群凈化工作，淘汰陽(yáng)性種雞、種蛋和種雛，選擇試驗(yàn)陰性母雞的受精蛋進(jìn)行孵化，在隔離條件下出雛飼養(yǎng)。

4.3 網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥又稱生長(zhǎng)抑制綜合征，引起嚴(yán)重的免疫抑制或免疫耐受，患病禽瘦小，羽毛發(fā)育異常[8]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，目前網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥存在一定感染，對(duì)600份健康雞全血進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥陽(yáng)性雞11只，其中艾維茵雞的陽(yáng)性率最低，為4.3%，海蘭雞的陽(yáng)性率最高，為5.5%。檢查200份有癥狀雞，禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病死雞為11只，其中AA肉雞病死率最低，為4.4%，海蘭雞病死率最高，為6.7%。應(yīng)采取凈化措施，淘汰陽(yáng)性雞，減少經(jīng)濟(jì)損失。

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