李 斌 ，梁家幸 ，蘇乾蓮 ，趙 武 ，秦毅斌 ，何 穎 ，盧冰霞 ，3，段群棚 ，李瑩瑩 ，3，姜佳佳 ，3，梁保忠

（1.廣西獸醫(yī)研究所，廣西南寧 530001；2.廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530001；3.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530005）

細(xì)胞培養(yǎng)始于20世紀(jì)初（Harrison 1907，Carrel 1912），現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)各個領(lǐng)域[1]。在獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，培養(yǎng)細(xì)胞對于動物病毒的體外增殖培養(yǎng)、動物病毒疫苗的研制等都是必不可少的。豬細(xì)小病毒（porcine parvovirus， PPV）是Mary和Mahnel于1966年從豬瘟病毒組織培養(yǎng)中首次發(fā)現(xiàn)，并認(rèn)為是培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)潛伏感染的病毒[2]。筆者實(shí)驗(yàn)室長期從事動物病毒學(xué)的研究，日常進(jìn)行豬腎細(xì)胞系IBRS-2、PK-15、倉鼠腎細(xì)胞BHK等細(xì)胞的培養(yǎng)，用于動物病毒的增殖培養(yǎng)。在數(shù)次豬腎細(xì)胞系IBRS-2培養(yǎng)過程中觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞產(chǎn)生類似PPV感染的病變，懷疑為PPV感染，于是應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction， PCR）技術(shù)對病變細(xì)胞進(jìn)行PPV核酸的檢測，結(jié)果為陽性，現(xiàn)報告如下。

1 料與方法

1.1 出現(xiàn)病變的細(xì)胞

將細(xì)胞培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)類似PPV感染病變（即細(xì)胞收縮，細(xì)胞顆粒增多，折光度增強(qiáng)，細(xì)胞崩解，部分從瓶壁脫落）的IBRS-2細(xì)胞（圖 1）－20 ℃凍融3次，3 000 r/min離心10 min，取上清液，用于檢測PPV核酸。

1.2 正常的細(xì)胞

細(xì)胞培養(yǎng)過程中未發(fā)現(xiàn)病變的正常IBRS-2細(xì)胞（圖 2）處理方法同1.1。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)用成份

胰酶、新生牛血清、谷氨酰胺、MEM、雙抗（青霉素+鏈霉素）均購自生化試劑藥品公司；無離子水為廣西康普動物保健品有限公司制備的雙蒸無離子水（ddH2O）。將細(xì)胞培養(yǎng)所用試劑溶液－20℃凍融3次，5 000 rpm離心10 min，取上清液，用于檢測PPV核酸。

1.4 PPV陽性對照

為廣西獸醫(yī)研究所蔣玉雯等[3，4]分離并增殖保存的PPV自然弱毒株（PPV-N株）。

1.5 PCR試劑

DNA抽提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，Taq酶購自Fermentas公司，dNTPs購自生工生物工程（上海）有限公司，DNA Marker購自廣州東盛生物科技有限公司，雙蒸無離子水（ddH2O）由廣西康普動物保健品有限公司制備。

1.6 PCR引物設(shè)計與合成

參考趙俊龍等方法[5]，設(shè)計合成一對引物，引物序列如下，PP1：5’- cag aat cag caa cct cac-3’，PP2：5’- tgg tct cct tct gtg gta gg -3’， 預(yù)期PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為445 bp。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.7 DNA模板的提取

將出現(xiàn)類似PPV感染病變的IBRS-2細(xì)胞、未出現(xiàn)病變的IBRS-2細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)所用的胰酶液、新生牛血清、谷氨酰胺液、MEM液、雙抗液、ddH2O、PPV-N株，凍融3次后的離心上清液200 μL，用DNA抽提試劑盒進(jìn)行DNA模板的提取，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.8 PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)采用25 μL反應(yīng)體系，其組成如下：10×PCR Buffer 2.5 μL，MgCl2（25 mmol/L）1.7 μL，dNTPs（10 mmol/L）0.6 μL，引物 PP1、PP2（25 μmol/L）各 0.7 μL，Taq 酶（5 U/μL）0.4 μL，ddH2O 13.4 μL，DNA 模板 5 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性4 min，進(jìn)入94 ℃ 40 s， 57 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)，然后72 ℃延伸10 min，最后4 ℃ 終止反應(yīng)。

1.9 PCR產(chǎn)物的檢測

取 20 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，加入4 μL 6×Loadding Buffer，于混有EB替代物的1%瓊脂糖凝膠中以120 V 100 mA電泳40 min，于紫外燈下觀察電泳結(jié)果，并于凝膠成像系統(tǒng)拍照保存結(jié)果。

1.10 PCR產(chǎn)物的核苷酸序列測定

將類似PPV感染病變的IBRS-2細(xì)胞、PPV-N株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送由北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行純化、測序，獲得相應(yīng)的PPV擴(kuò)增片段核苷酸序列。

圖1 出現(xiàn)類似PPV感染病變的IBRS-2細(xì)胞（×400）

圖2 正常IBRS-2細(xì)胞（×400）

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

在細(xì)胞培養(yǎng)所用的胰酶、新生牛血清、谷氨酰胺、MEM、雙抗、ddH2O，及未出現(xiàn)PPV感染病變的2個批次IBRS-2細(xì)胞中均未檢測出PPV核酸。在2個PPV陽性對照（PPV-N株），5個批次出現(xiàn)類似PPV感染病變的IBRS-2細(xì)胞中均檢測出445 bp的PPV特異性核酸條帶（圖3）。

圖3 PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 PCR產(chǎn)物的核苷酸序列測定結(jié)果

將類似PPV感染病變的IBRS-2細(xì)胞5個樣品、PPV-N株2個樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，獲得7個樣品的PPV擴(kuò)增片段核苷酸序列。將這7條核苷酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫的5株P(guān)PV參考毒株（登錄號：AY583318、D00623、DQ675456、NC_001718、PPU44978）的相應(yīng)核苷酸序列進(jìn)行同源性比對，結(jié)果顯示：除了PPU44978 PPV毒株的相應(yīng)核苷酸序列與其余11條PPV相應(yīng)核苷酸序列的同源性均為99.5%，其余11條PPV相應(yīng)核苷酸序列的同源性均為100%。

3 討論

通過細(xì)胞病變觀察、PCR檢測和核苷酸序列測定，可證實(shí)本實(shí)驗(yàn)室數(shù)個批次培養(yǎng)的IBRS-2細(xì)胞被PPV感染。細(xì)胞感染PPV的可能原因有多種，最主要的原因有如下兩個：（1）PPV在自然環(huán)境中廣泛存在，抵抗力強(qiáng)，存活時間長，普通消毒方法很難殺滅[2]，所以PPV很容易污染細(xì)胞培養(yǎng)用的器皿、試劑，及操作者的手等，導(dǎo)致在細(xì)胞培養(yǎng)過程中PPV感染細(xì)胞；（2）某些采購的或向別的實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)的種細(xì)胞早期潛伏感染PPV，由于含量極其微小，剛開始培養(yǎng)時未能觀察出來，經(jīng)過多次細(xì)胞傳代才會顯現(xiàn)出PPV細(xì)胞病變。本次PCR檢測在細(xì)胞培養(yǎng)用試劑中均未檢出PPV核酸，且本實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)用器皿、操作環(huán)境、操作過程均經(jīng)過嚴(yán)格的消毒控制，所以本實(shí)驗(yàn)室IBRS-2細(xì)胞感染PPV基本可排除第一種原因，是由上述第二種原因引起的可能性較大。

PPV感染細(xì)胞普遍存在，感染的途徑復(fù)雜多樣。例如，李昌文等報道從豬腎細(xì)胞系PK15培養(yǎng)物中分離鑒定到一株內(nèi)源性 PPV（SY-99株）[6]。Croghan等報道，通過實(shí)驗(yàn)證明豬睪丸細(xì)胞系ST使用被PPV污染的胰蛋白酶消化而感染上PPV[7]。培養(yǎng)細(xì)胞尤其是制作疫苗的細(xì)胞感染病毒，其后果十分嚴(yán)重。例如，用感染PPV的細(xì)胞制作弱毒疫苗去免疫初產(chǎn)母豬，則會造成初產(chǎn)母豬流產(chǎn)、死胎、產(chǎn)木乃伊胎和不孕等繁殖障礙癥狀[2]，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。所以在進(jìn)行病毒培養(yǎng)尤其是PPV增殖培養(yǎng)時，一定要設(shè)置未接種PPV的空白細(xì)胞對照，以防PPV的非接種感染而出現(xiàn)的假陽性。若空白細(xì)胞對照出現(xiàn)PPV感染的細(xì)胞病變且PCR檢測為PPV陽性，可判斷培養(yǎng)用細(xì)胞之前已被PPV感染，則同批次的PPV增殖細(xì)胞全部都要棄去。

檢測PPV病原的方法有多種：病毒分離、電鏡觀察、血凝試驗(yàn)（HA）、血凝抑制試驗(yàn)（HI）、間接免疫熒光法（IFA）、單克隆抗體技術(shù)（McAb）、核酸探針技術(shù)（NAP）、銀加強(qiáng)膠體金技術(shù)（SECGA）、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）等[8]。其中，PCR技術(shù)為首選檢測方法，因?yàn)槠渌椒ù嬖诨蚝臅r長、或操作復(fù)雜、或檢測成本高等不足。Kary Mullis于上世紀(jì)八十年代發(fā)明的PCR技術(shù)是一種對特定DNA片段在體外進(jìn)行快速擴(kuò)增的方法，其具有特異、靈敏、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動化等優(yōu)點(diǎn)?，F(xiàn)在PCR技術(shù)廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、生物工程、醫(yī)學(xué)、法醫(yī)學(xué)和農(nóng)學(xué)等領(lǐng)域，并在此基礎(chǔ)上創(chuàng)造了許多DNA體外擴(kuò)增的新技術(shù)[9]。本次檢測參考趙俊龍等建立的PCR檢測方法，該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，可以檢測到10-4個TCID50的PPV含量，其敏感性甚至要優(yōu)于之前報道的PPV套式PCR方法的敏感性（1個TCID50）[5]。所以應(yīng)用該P(yáng)CR檢測方法，可以檢測出細(xì)胞培養(yǎng)試劑中可能污染含量極低的PPV及某些種細(xì)胞中可能早期潛伏感染的PPV，這對于避免培養(yǎng)細(xì)胞感染PPV具有重要的意義。

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