梁丹潔，歐 瑩，李春英，蔣家霞，張欣明，孫翔翔，曾詠芳，周師師，吳 軍，熊 毅

（1.廣西大學動物科學技術學院，廣西南寧 530004；2.廣西區(qū)動物疫病預防與控制中心，廣西南寧 530004）

禽I型副黏病毒（Avain Paramyxovirus I，APMV-I）屬于副黏病毒科，副黏病毒亞科、腮腺病毒屬，其基因組為無節(jié)段的負鏈單股RNA病毒，大小約為15kb，主要編碼6種蛋白質(zhì)[1]，其中HN蛋白在病毒脂囊膜上形成纖突，主要負責細胞受體和病毒粒子之間的結(jié)合，以破壞這種結(jié)合的拮抗作用，它還通過促使F蛋白充分接近細胞，引起病毒囊膜與細胞融合，從而進一步啟動感染過程[2]。有文獻研究表明，HN的基因突變可能導致具有不同致病性的APMV-I變異株的不斷產(chǎn)生，HN對毒力也有一定的影響[3]。近年來，APMV-Ⅰ宿主范圍的不斷擴大，不僅打破了“APMV-Ⅰ不感染水禽或感染不發(fā)病”的傳統(tǒng)理論[4-5]，而且還從最初的禽類宿主到現(xiàn)在的哺乳動物跨種間傳播，感染譜的不斷擴大，對人類公共衛(wèi)生也存在潛在的威脅。本研究對從馬身上分離獲得M10株的HN基因進行克隆測序，并與已發(fā)表的HN基因序列進行同源性分析、繪制系統(tǒng)進化樹，旨在從分子生物學水平為該病的預防和控制提供理論依據(jù)，并希望能夠在分子水平上找出導致APMV-I病毒跨越種屬宿主改變的可能原因，從而為同源或近源跨越種屬引起人類疾病的病原體的研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

總RNA抽提試劑盒、Marker 2000、DH5a大腸埃希菌感受態(tài)細胞、質(zhì)粒抽提取試劑盒購自天根公司；膠回收試劑盒、ExTaqDNA 聚合酶、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、HIR抑制酶、dNTPs、Mgcl2、PMD18-T質(zhì)粒載體、限制性內(nèi)切酶等購自大連寶生物有限公司。PCR反應儀、超速離心機、移液器等。

1.2 病毒株

馬源禽I型副黏病毒M10株由廣西動物疫病預防控制中心家畜診斷科分離、鑒定。

1.3 HN基因的克隆與測序

1.3.1 引物的合成與設計

根據(jù)GenBank中已發(fā)表的鵝副黏病毒GPVSF02株全基因組序列，通過Oligo軟件設計了擴增HN基因的2對上下游引物（表1），引物由大連寶生物Takara公司合成。將其稀釋成25 pmol/μL，-20 ℃分裝，備用。

表1 HN基因擴增引物序列

1.3.2 病毒RNA的抽提

取病毒液按照天根公司總RNA抽提試劑盒說明書進行抽提取RNA。

1.3.3 RT-PCR反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應

將上述抽提取所得的RNA為模板，HN1、HN2下游引物為反轉(zhuǎn)錄引物，合成第一鏈cDNA。取5μL cDNA并進行下一步PCR反應，PCR反應循環(huán)體系為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性50 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，總共38個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應后的PCR產(chǎn)物可以直接進行瓊脂糖凝膠電泳。

1.4 目的基因的膠回收、連接、酶切鑒定以及克隆測序

膠回收按照Takara膠回收試劑盒進行。按DNA連接試劑盒說明書將回收純化后的目的基因與PMD18-T載體連接，置4℃過夜。然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞DH5ɑ中，涂布于添加有Amp（100 μg/mL）的LA培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12-16h，挑取上述生長良好的白色菌落，接至含有Amp（100 μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)16 h 。取1.0-1.5 ml培養(yǎng)物提取重組質(zhì)粒，進行雙酶切及質(zhì)粒PCR鑒定，篩選出兩者均為陽性的菌株送大連寶生物工程有限公司進行測序。

1.5 HN基因序列分析

根據(jù)M10的HN基因5’端與3’ 端cDNA的核苷酸序列測定結(jié)果，將HN基因5’端與3’端的核苷酸序列進行拼接，并將完整的HN基因序列通過NCBI blast與GeneBank中收錄的APMV-I核苷酸序列進行類似性檢索。用DNAStar.Lasergene.v7軟件來分析其與參考株的同源性以及構(gòu)建基因進化樹。

2 結(jié)果

2.1 HN基因擴增結(jié)果

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析表明，利用鵝副黏病毒HN基因的特異性引物擴增出長度分別為1226、1202bp左右的2條帶，與預期結(jié)果相符。

2.2 目的基因的重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果

本毒株HN基因的2個片段重組質(zhì)粒用（Sal I和EcoRI雙酶切），可分別見1226bp，2650bp；1202bp，2650bp左右的兩個片段，分別為目的基因和pMD18-T載體，與預期結(jié)果相符。

2.3 馬源禽I副黏病毒HN全基因各片段的克隆和測序

篩選出陽性克隆后進行序列測定，運用DNAStar軟件包中SeqMan程序?qū)λ眯蛄羞M行拼接，該毒株HN基因約為2.0kb，ORF為1716個堿基，編碼571個氨基酸。

2.4 HN基因的編碼區(qū)序列和其推導的氨基酸序列同源性比較

利用DNAStar中Megalign程序?qū)10株的HN基因編碼區(qū)與從Genbank下載的基因序列進行同源性分析比較可得：其編碼區(qū)核苷酸序列的同源性在80.9-99.2%之間。其中與雞源YG03（DQ228931.1）、NDV-03-044（GQ33831.1） 同源性最高，分別為99.2%與97.3 %；而與雞源經(jīng)典毒株B1（AF309418）、Lasota（AF077761）、強毒株F48E9（AY997298.1）同源性最低，分別為80.9%、81.2%、84.4%；與鴨源、鵝源、鸚鵡源、海鷗源、野鳥源相比較，同源性在91.4%～95.9%之間。而由M10株編碼區(qū)推導的氨基酸序列與其他毒株相比，同源性在88.6%～98.6%之間（表2）。

2.5 編碼區(qū)核苷酸序列進化樹分析

表2 M10分離株與標準株HN基因編碼區(qū)核苷酸和氨基酸同源性比較（%）

根據(jù)HN基因的編碼區(qū)核苷酸序列進行系統(tǒng)進化樹分析（圖1），從圖中可以看出M10株與雞源YG03、NDV-03-044，鴨源FP1，鵝源SF02等系統(tǒng)發(fā)育關系較近，而與傳統(tǒng)經(jīng)典疫苗株Lasota、B1，經(jīng)典強毒株F48E9相距較遠。

圖1 HN基因比較的遺傳進化樹

2.6 HN蛋白的半胱氨酸位點與糖基化位點分析

由M10 株HN基因編碼區(qū)推導出的氨基酸序列可得，M10株有13個半胱氨酸殘基位點，分別 位 于 123、172、186、196、238、247、251、344、455、461、465、531、542位氨基酸位點處。

在糖基化位點分析上，M10株有5個保守的糖基化位點，分別位于115、119、341、433、508位氨基酸殘基處。

3 討論

副黏病毒HN基因預測的ORF框架長度與終止密碼子的位置有差異，其翻譯出的多肽長短不同，根據(jù)翻譯出的多肽長度可將其分為3個型，相對應的片段長度為1713bp、1731bp以及1848bp，分別翻譯出571、577、616個氨基酸[6]。研究表明多肽為571個氨基酸時為強毒株[7]。廣西馬源禽I型副粘病毒M10株的HN基因約為2.0kb，ORF為1716個堿基，共編碼571個氨基酸，說明M10株HN基因蛋白的大小具備強毒株特征。HN基因同源性比較以及系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)，M10株與雞源YG03、NDV-03株，鴨源FP1、鵝源SF02同源性最高，說明這些病毒有可能來自同一祖先，而與經(jīng)典株Lasota、B1、F48E9相距甚遠，說明與過去流行的傳統(tǒng)毒株相比，M10株HN基因有了較大的變異。禽I型副粘病毒HN蛋白中的半胱氨酸（Cys）殘基、糖基化位點對HN蛋白的結(jié)構(gòu)功能起重要作用。國內(nèi)外已報告的APMV-I型的強毒株一般含有13個半胱氨酸位點[8]；而潛在的糖基化位點有6個，一般在119、341、433、481、508及538位，前4個可以被糖基化，而后兩個不用于糖基化[9]。據(jù)報道，一些國內(nèi)的APMV-I分離株缺少第538位的糖基化位點[10]。本研究的M10株HN基因含有13個半胱氨酸位點，與國內(nèi)外毒株相比較，其數(shù)目和位置相對保守，糖基化位點有5個，第538-540位無糖基化位點特征，但是，這并不影響HN蛋白的結(jié)構(gòu)特征。

近年來，禽I型副黏病毒的宿主范圍變得越來越廣泛，迄今已知能自然或人工感染的鳥類超過205多種，世界各地相繼從豬、甚至人體內(nèi)也分離到了禽I型副黏病毒[11-13]。出現(xiàn)這種情況與不健全的飼養(yǎng)模式有密切關系，家禽與家畜混養(yǎng)，飼養(yǎng)場地消毒不徹底，禽畜市場管理不嚴格等情況都有可能使得APMV-I病毒在家禽、家畜、人之間傳播；另外，南方屬于全球候鳥的遷徙線路上，有學者預測，鴿子、八哥等野生鳥類活動廣泛，喜歡啄食豬背部蜱、蚊蟲等，是豬感染APMV-I的可能途徑之一[14]。而從人體分離到的新城疫病毒與先前在歐洲與北美從鴿子身上分離到的新城疫病毒有較高的同源性，并且具有強毒株的特點，可以考慮，鴿也可能是人類新城疫病毒的主要來源[15]。由此可推斷，APMV-I也有可能通過以上途徑傳播至馬身上并發(fā)生變異。越來越多的數(shù)據(jù)表明，APMA-I的宿主范圍在不斷的擴大，給人類健康帶來了不可忽視的影響，因此加強APMA-I的分子流行病學調(diào)查，以及不同宿主源性APMA-I毒株演化分析具有重大意義。

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