張喜悅 ，呼西旦，曹 瑞 ，杜鵬飛 ，努爾拜合提 ，古努爾·吐爾遜 ，孫照剛 ，范偉興

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.新疆牧科院獸醫(yī)研究所，新疆烏魯木齊 830000； 3.北京市胸部腫瘤結(jié)核病醫(yī)院，北京 101149）

牛結(jié)核病主要是由牛結(jié)核分枝桿菌引起的一種人畜共患病[1]，大多數(shù)牛不呈顯性感染或僅到晚期才出現(xiàn)臨床癥狀，故臨床診斷不易獲得準確結(jié)果。目前常用的牛結(jié)核檢疫方法有變態(tài)反應(yīng)等免疫學(xué)方法，但在發(fā)達國家，仍然以細菌的分離和鑒定作為牛結(jié)核診斷方法的金標準[2-5]。我國在牛結(jié)核分枝桿菌的分離和鑒定上研究較少，這也成立制約我國確診牛結(jié)核病例的關(guān)鍵因素。

傳統(tǒng)的牛結(jié)核分枝桿菌鑒定方法主要包括細菌形態(tài)、染色特性和生化鑒定等，這些鑒定方法操作較為復(fù)雜且需時較長。隨著結(jié)核分枝桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌和多種非典型分枝桿菌的序列測定完畢，很多科學(xué)家通過比較基因組學(xué)設(shè)計引物，利用多重PCR方法快速鑒定結(jié)核分枝桿菌。如Wilton等建立了可以鑒定多種分枝桿菌的分枝桿菌多重PCR[6]，Richard等建立可以區(qū)分牛結(jié)核分枝桿菌和人結(jié)核分枝桿菌的結(jié)核分枝桿菌群（MTC）PCR方法[7]。我們在檢疫出結(jié)核陽性牛并撲殺后，采集了病料進行細菌分離，然后進行多重PCR快速鑒定為牛結(jié)核分枝桿菌感染。

1 材料與方法

1.1 酶類、培養(yǎng)基和引物

Taq DNA聚合酶（5U/μL）、PCR Master等購自大連寶生物公司；DNA Marker 、EB（溴化乙錠）（100kb DNA ladder）等購自Promega公司。Middle brook 7H11培養(yǎng)基，購自美國BD公司。按照表1所示序列，PCR引物由大連寶生物公司合成。

表1 合成的引物序列

1.2 標準菌株

牛分枝桿菌標準株M.bovis（ATCC 55235）均由北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所細菌免疫研究實驗室提供。

1.3 結(jié)核陽性牛的撲殺

利用比較變態(tài)反應(yīng)和伽馬干擾素試驗檢疫牛群，抽檢在2種方法中均為陽性的牛撲殺，觀察陽性牛的結(jié)核病變。

1.4 分枝桿菌的培養(yǎng)

無菌條件下，采集結(jié)核病變，加入適量的滅菌生理鹽水，經(jīng)研磨器勻漿處理后，加入2倍體積的4%硫酸，室溫下處理病料15～20 min。利用生理鹽水再將處理過的病料做10倍稀釋，用移液器分別接種0.2 mL至Middle brook 7H11 培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)6周，觀察結(jié)果。

1.5 分離菌株的滅活與染色鑒定

將初次培養(yǎng)的結(jié)核菌落再次接種到Middle brook 7H11 培養(yǎng)基上擴大培養(yǎng)。分別將擴大培養(yǎng)好的臨床分離菌株和牛結(jié)核分枝桿菌標準株轉(zhuǎn)移到密閉的含有生理鹽水的試管中，將試管置于水浴鍋，經(jīng)80℃ 2h滅活。用分枝桿菌特異性Ziehl-Neelsen（Z-N）方法染色，于顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.6 分離菌株的分枝桿菌多重PCR鑒定

1.6.1 分枝桿菌多重PCR方法 以滅活的分離菌株作為樣品，以牛分枝桿菌標準株作為陽性對照，用 Mycgen、 TB1 、Mycav和 Mycint 4對引物進行擴增。反應(yīng)體系為20μL：樣品2 μL，4對引物（Mycgen、TB1、Mycav和Mycint）的上下游引物各 1 μL，PCR Master 10 μL。反應(yīng)程序為：循環(huán) 1：94℃ 10min，61℃ 2min，72℃ 3min，1個循環(huán)；循環(huán)2：94℃ 1min，61℃ 2min，72℃3min，33個循環(huán)；循環(huán)3，94℃10min，61℃ 2min，72℃ 3min，1個循環(huán)后置4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后取5μL產(chǎn)物進行1%瓊脂糖電泳，紫外凝膠成像分析系統(tǒng)上觀察結(jié)果。

1.6.2 分枝桿菌多重PCR判定標準 引物MYCGEN-F和MYCGEN-R擴增出1030bp片段表明為分枝桿菌種；TB1-F和TB1-R擴增出372bp片段，表明為MTC群（包括人分枝桿菌和牛分枝桿菌等）；MYCA－F和MYCA－R擴增出180bp片段，表明為禽分枝桿菌，MYCINT-F和MYCINT-R擴增出850bp片斷，表明為胞內(nèi)分枝桿菌。

1.7 臨床分離株的MTC PCR鑒定

1.7.1 MTC PCR方法 以滅活的分離菌株作為樣品，分別用16S RNA、Rv0577、IS1561、Rv1510和Rv1970 5對引物進行擴增。每對引物的反應(yīng)體系為20μL：樣品2 μL，每對引物的上下游引物各1 μL，PCR Master 10μL，不足部分用水補齊。反應(yīng)程序為：94 ℃ 5 min初次變性，然后94℃變性1 min 、60℃ 退火 1 min、72℃ 延伸 1 min，共經(jīng)35個循環(huán)，最后于72℃延伸10 min結(jié)束反應(yīng)，并于4℃保存反應(yīng)產(chǎn)物。取5μL產(chǎn)物進行1%瓊脂糖電泳，紫外凝膠成像分析系統(tǒng)上觀察結(jié)果。

1.7.2 MTC PCR判定標準 MTC群內(nèi)定型多重PCR中，對于人結(jié)核分枝桿菌，5對引物均有產(chǎn)物擴增，而牛結(jié)核分枝桿菌僅有16S RNA、Rv0577和IS1561 3對引物擴增，而引物Rv1510和Rv1970則無擴增。

2 結(jié)果

2.1 病理解剖結(jié)果

利用比較變態(tài)反應(yīng)和伽馬干擾素試驗檢疫牛群，抽檢在2種方法中均為陽性的牛撲殺，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了明顯的結(jié)核病變，在肺部形成大小不等的結(jié)核結(jié)節(jié)，多數(shù)為珍珠樣大小，但也有呈雞蛋大的結(jié)節(jié)。將結(jié)節(jié)切開后，可見內(nèi)有明顯的干酪樣壞死（圖1）。

圖1 充滿干酪樣壞死的雞蛋大結(jié)節(jié)

2.2 細菌分離結(jié)果

將結(jié)節(jié)內(nèi)的干酪樣壞死取出，勻漿后經(jīng)酸處理，接種于Middle brook 7H11培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)6周，可見有不透明的顆粒狀菌落生長，表面皺褶粗糙，呈乳白色結(jié)節(jié)狀，證實分離菌株生長良好。將分離菌株再次接種到Middle brook 7H11培養(yǎng)基上擴大培養(yǎng)6周。

2.3 染色鑒定結(jié)果

滅活后的臨床分離菌株經(jīng)分枝桿菌特異性Ziehl-Neelsen（Z-N）方法染色后，于高倍顯微鏡下（500倍）觀察，可見有呈紅色的火柴棒樣細長桿菌，呈排列無序，因此可以高度懷疑其為分枝桿菌（圖2）。

圖2 分離菌株的Ziehl-Neelsen染色結(jié)果

2.4 分枝桿菌多重PCR鑒定結(jié)果

以滅活的分離菌株作為樣品，以牛分枝桿菌標準株作為陽性對照，進行分枝桿菌多重PCR。反應(yīng)結(jié)束后取5μL產(chǎn)物進行1%瓊脂糖電泳，紫外凝膠成像分析系統(tǒng)上觀察。結(jié)果陽性對照成立，而臨床樣品分離菌株同牛分枝桿菌標準株一樣，引物MYCGEN-F和MYCGEN-R有1030bp片段擴增，引物TB1-F和TB1-R有372bp片段擴增。證實分離菌株屬于MTC群（圖3）。

圖3 MTC群多重PCR鑒定結(jié)果

2.5 MTC PCR

以滅活的分離菌株作為樣品，用16S RNA、Rv0577、IS1561、Rv1510和Rv1970 5對引物進行MTC群內(nèi)多重PCR。擴增結(jié)束后取5μL產(chǎn)物進行1%瓊脂糖電泳，紫外凝膠成像分析系統(tǒng)上觀察。結(jié)果分離菌株在16S rRNA、 Rv0577和IS1561 3對引物處有擴增，片段大小依次為543bp、786bp和943bp，而 Rv1510和Rv1970 2對引物則無擴增，因此將分離菌株鑒定為牛結(jié)核分枝桿菌（圖4）。

3 討論

3.1 細菌分離的重要性

圖4 臨床分離株的MTC群內(nèi)定型多重PCR鑒定結(jié)果

發(fā)達國家最后確診牛結(jié)核病的最終依據(jù)仍然是細菌分離[2-5]。但由于我國沒有結(jié)核陽性牛撲殺后必須進行細菌分離的規(guī)定，而且國內(nèi)缺乏與牛結(jié)核相關(guān)的生物安全實驗室和培養(yǎng)方法不科學(xué)等諸多原因，導(dǎo)致我國在牛結(jié)核分枝桿菌的分離和鑒定上研究較少。我們采集了臨床上的牛結(jié)核結(jié)節(jié)，在我國人結(jié)核參比實驗室內(nèi)，用營養(yǎng)豐富的Middle brook 7H11培養(yǎng)基，最終大量培養(yǎng)了牛結(jié)核分枝桿菌，這也為我國能夠最終確診牛結(jié)核奠定了堅實的基礎(chǔ)。

3.2 非特異性分枝桿菌對牛結(jié)核細菌分離的干擾

我國的很多變態(tài)反應(yīng)結(jié)核陽性牛，臨床上無任何臨床癥狀，撲殺后也沒有可見的病理變化，這在很大程度上是由于非特異性分枝桿菌的感染引起的[8，9]。牛場中往往存在有大量的沒有致病性的非特異性分枝桿菌。如草分枝桿菌等不會引起任何動物發(fā)病；禽分枝桿菌雖然能夠引起禽發(fā)病，但牛感染后并不表現(xiàn)任何癥狀，也不會傳染給人，而且人類只有在缺乏免疫力如患有艾滋病等的情況下才會感染禽分枝桿菌，因此發(fā)達國家并不撲殺禽結(jié)核陽性牛[2-5]。但這些非特異分枝桿菌感染牛后，不僅干擾變態(tài)反應(yīng)檢疫，還會干擾牛結(jié)核細菌分離的準確性。因此臨床菌株分離后，必須要并對其進行鑒定，以排除非特異性分枝桿菌的干擾。

3.3 關(guān)于MTC群內(nèi)定型多重PCR

牛結(jié)核病在很多情況下也可以由人分枝桿菌引起，而且很難通過生化試驗等傳統(tǒng)方法進行鑒別。分枝桿菌的比較基因組學(xué)分析顯示，不同分枝桿菌基因組的缺失區(qū)域（RD）有明顯不同，如RD7區(qū)在人結(jié)核分枝桿菌中存在但在牛型分枝桿菌中則缺失，因此可以針對這些區(qū)域建立PCR方法以鑒別牛結(jié)核分枝桿菌和人結(jié)核分枝桿菌[7]。本試驗中的臨床分離株的擴增結(jié)果與牛結(jié)核分枝桿菌完全一樣，因此將其鑒定為牛結(jié)核分枝桿菌。

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