董志珍，鄭文杰，王乃福，趙祥平，吳冬雪，王玉玲，馬 晶，賈潤(rùn)清，王建華，張曉光

（1.天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心，天津 300456；2.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100052）

H7N9禽流感是由H7N9亞型禽流感病毒引起的禽類疾病，原本屬于低致病性流感病毒，長(zhǎng)期以來(lái)僅有其來(lái)源于野鳥(niǎo)的報(bào)道。但2013年3月下旬，H7N9亞型禽流感病毒跨越種屬，人類感染H7N9病毒的患者在上海、江蘇，陸續(xù)又在中國(guó)多個(gè)省份被發(fā)現(xiàn)，這是該病毒全球首次感染人類。截止5月11日，全國(guó)內(nèi)地共報(bào)告人感染H7N9禽流感確診病例130例，其中死亡人數(shù)33人，H7N9禽流感已經(jīng)成為我國(guó)及周邊國(guó)家和地區(qū)公共衛(wèi)生機(jī)制新的考驗(yàn)。同時(shí)，由于H7N9禽流感的爆發(fā)，國(guó)內(nèi)家禽養(yǎng)殖業(yè)受到巨大影響，周邊國(guó)家越南和印尼已經(jīng)禁止從我國(guó)進(jìn)口家禽，國(guó)家和家禽養(yǎng)殖戶蒙受巨額經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)統(tǒng)計(jì)，此次人感染H7N9禽流感病毒出現(xiàn)前，全球共檢出25株H7N9亞型流感病毒，均來(lái)自野鳥(niǎo)，從未在家禽中發(fā)現(xiàn)，因此快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)家禽樣品中是否含有H7N9亞型禽流感病毒將有助于控制H7N9禽流感在人群間的傳播，并為我國(guó)的家禽養(yǎng)殖業(yè)動(dòng)物及其產(chǎn)品的正常貿(mào)易提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。

通常，禽流感的診斷主要依靠流行病學(xué)與臨床診斷，確診依賴于病毒分離、病毒抗原與血清抗體等監(jiān)測(cè)。病毒分離和血凝抑制試驗(yàn)是檢測(cè)AIV和鑒定其亞型的標(biāo)準(zhǔn)方法，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力[1]。此次H7N9禽流感病毒在人群間傳播，國(guó)家流感中心及北京出入境檢驗(yàn)檢疫局分別建立了用于H7N9禽流感病毒檢測(cè)的熒光定量PCR檢測(cè)方法[2]，該方法快速，靈敏度高，但該方法對(duì)人員素質(zhì)及設(shè)備要求都很高，難于在基層診斷實(shí)驗(yàn)室普及應(yīng)用。Notomi 等開(kāi)發(fā)了一種恒溫核酸擴(kuò)增方法，即環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（loop －mediated isothermal am p l if ic at io n，LAMP），其特點(diǎn)是在等溫條件（65℃左右）下作用60 min 左右即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，更為重要的是此方法不需要貴重的儀器和試劑[3]，在水浴鍋中就能完成反應(yīng)，特別適合在野外現(xiàn)場(chǎng)和基層部門(mén)應(yīng)用[4]。近年來(lái)，LAMP 法已被成功地用于診斷發(fā)生于人類和動(dòng)物的病毒性疾病，成為檢測(cè)多種致病病毒的有效工具[5-6]。我們依據(jù)H7N9 亞型禽流感病毒的HA基因和NA基因序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)了LAMP 引物，以所構(gòu)建的陽(yáng)性質(zhì)粒為模板，建立了一種H7N9 禽流感病毒的LAMP早期快速檢測(cè)方法。

1 材料和方法

1.1 材料

禽流感H7N9（安徽株）滅活病毒由國(guó)家流感中心舒躍龍教授惠贈(zèng)；總RNA提取試劑盒、DNA提取試劑盒、Bst DNA聚合酶、M-MULV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑購(gòu)自NEB公司； 質(zhì)粒小量提取試劑盒、大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自TIANGEN公司；Betaine（甜菜堿）、MgSO4購(gòu)自Sigma公司。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)登錄于GISAID數(shù)據(jù)庫(kù)的H7N9禽流感HA基因和NA基因序列，應(yīng)用生物學(xué)軟件進(jìn)行序列比對(duì)，在HA和NA的保守區(qū)利用PrimerExplorer V4設(shè)計(jì)了2對(duì)引物（外引物和內(nèi)引物）。熒光定量PCR所用引物和探針為國(guó)家流感中心公布，所有探針、引物的合成修飾由英俊公司完成，序列見(jiàn)表1。

表1 引物和探針序列

1.3 RNA的提取及cDNA的制備

取經(jīng)DEPC 水處理過(guò)的EP管， 加入1 mL Trizol 和200mL滅活病毒液，混勻后室溫放置5 min；加入200 mL 氯仿，用力搖晃30 s，室溫靜置3 min，4℃離心15 min，液體分層；取上層液移入干凈的EP 管， 加入500 mL 異丙醇，-20℃靜置30min，4℃離心15 min；移去上層懸液；加入1 mL 75%的DEPC 乙醇，渦旋振蕩，4℃離心10 min；去上清，空氣中干燥5 min； 向試管中加入50 mL DEPC 水。參照M-MuLV 反轉(zhuǎn)錄酶過(guò)程進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄， 得到cDNA，-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 陽(yáng)性重組質(zhì)粒的構(gòu)建

利用針對(duì)H7N9禽流感HA基因和NA基因的特異性引物，將cDNA在50mL 體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的PCR 產(chǎn)物純化后克隆到pGEM-T easy載體中并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TOP10 感受態(tài)細(xì)胞中，從純化擴(kuò)增的重組菌中提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定，HA重組質(zhì)粒用EcoRⅠ，NotⅠ雙切，NA重組質(zhì)粒用sfi I單切鑒定，選取陽(yáng)性重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，從而為檢測(cè)提供陽(yáng)性質(zhì)粒，并利用此陽(yáng)性質(zhì)粒對(duì)LAMP 方法進(jìn)行優(yōu)化。

1.5 H7N9亞型禽流感病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法檢測(cè)

1.5.1 H7N9亞型禽流感病毒HA基因區(qū)的檢測(cè)

經(jīng)過(guò)摸索和優(yōu)化反應(yīng)條件后，建立如下擴(kuò)增反應(yīng)體系： 2mL cDNA樣品、5mL Bst DNA 聚合酶緩沖液（10×）、2mL Bst DNA 聚合酶（8000U/ L）、5mL dNTP（10mmol/L）、3mL Betaine（5mol/L）、6mL Mg SO4（25mmol/L）、對(duì)應(yīng)于HA基因的引物 FIP和 BIP各 4mL、F3和 B3各 0.5mL、6mL H2O?；靹颍?5 ℃，水浴1.5h。

1.5.2 H7N9亞型禽流感病毒NA基因區(qū)的檢測(cè)

方法與HA 基因區(qū)的檢測(cè)相同， 使用的引物為對(duì)應(yīng)于NA 基因區(qū)的4條特異性引物。

1.6 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)

LAMP 反應(yīng)結(jié)束后，取5mL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳；其余擴(kuò)增產(chǎn)物采用熒光染料法同步檢測(cè)，向擴(kuò)增管中加入2mL 50倍稀釋的SYBR Green Ⅰ染料，在紫外燈和日光下觀察反應(yīng)管顏色變化?；厥誋A 和NA 基因的陽(yáng)性產(chǎn)物， 并以此為模板進(jìn)行普通PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工測(cè)序。

1.7 H7N9禽流感病毒HA和NA基因的檢測(cè)靈敏度

取陽(yáng)性質(zhì)粒DNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，10倍系列稀釋后，進(jìn)行H7N9禽流感病毒HA和NA基因的靈敏度檢測(cè)試驗(yàn)。具體試驗(yàn)方案參照LAMP的常規(guī)操作程序進(jìn)行。

1.8 特異性試驗(yàn)

分別以H1型、H3型、H5型禽流感病毒和新城疫病毒（NDV）核酸作為待測(cè)樣品，以所提取的H7N9亞型禽流感病毒質(zhì)粒DNA為陽(yáng)性對(duì)照，以經(jīng)DEPC處理的水為陰性對(duì)照，檢驗(yàn)方法的特異性。

1.9 H7N9禽流感病毒的熒光定量PCR檢測(cè)

H7N9 亞型禽流感病毒核酸的定量檢測(cè)按國(guó)家流感中心發(fā)布的“H7N9禽流感病毒熒光定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程”內(nèi)容進(jìn)行。同時(shí)，進(jìn)行LAMP檢測(cè)作為平行對(duì)照，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析和比較。

2 結(jié)果

2.1 H7N9 亞型禽流感病毒HA基因和NA基因的擴(kuò)增

取滅活病毒液，提取病毒基因組后，參照M-MuLV 反轉(zhuǎn)錄酶過(guò)程進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄， 得到cDNA，利用特異性引物對(duì)H7N9 亞型禽流感病毒HA基因和NA基因進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示，經(jīng)擴(kuò)增后得到HA基因1683bp，NA基因1398bp，與理論擴(kuò)增值相符。

圖1 HA基因和NA基因擴(kuò)增圖

2.2 陽(yáng)性重組質(zhì)粒的鑒定

將擴(kuò)增后的HA 和NA基因，克隆到pGEM-T easy載體中并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TOP10 感受態(tài)細(xì)胞中，從純化擴(kuò)增的重組菌中提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定，HA重組質(zhì)粒用EcoRⅠ，NotⅠ雙切，NA重組質(zhì)粒用sfi I單切，結(jié)果如圖2所示。構(gòu)建的HA和NA重組質(zhì)粒經(jīng)酶切后均得到與理論相符的目的條帶。取構(gòu)建好的陽(yáng)性質(zhì)粒測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示擴(kuò)增序列與登錄于GISAID數(shù)據(jù)庫(kù)的H7N9序列一致性為100%，表明所構(gòu)建的質(zhì)粒確實(shí)含有目的基因片段，可以作為陽(yáng)性質(zhì)粒使用。

圖2 HA和NA重組質(zhì)粒酶切圖

2.3 H7N9亞型禽流感病毒LAMP方法的檢測(cè)

2.3.1 凝膠電泳結(jié)果觀察

經(jīng)過(guò)摸索和優(yōu)化反應(yīng)條件后，建立針對(duì)H7N9亞型禽流感病毒HA基因區(qū)和NA基因區(qū)的LAMP檢測(cè)方法，檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，HA基因區(qū)（2、3）和NA基因區(qū)（6）的擴(kuò)增結(jié)果中核酸電泳條帶呈階梯狀分布，與理論結(jié)果相符，陰性對(duì)照（4、7）未見(jiàn)特異性產(chǎn)物出現(xiàn)。

2.3.2 染色結(jié)果觀察

LAMP方法擴(kuò)增產(chǎn)物中加入2mL 50倍稀釋的SYBR Green Ⅰ進(jìn)行染色，在紫外燈和日光下觀察反應(yīng)管顏色變化。圖4所示，HA和NA基因陽(yáng)性擴(kuò)增管在可見(jiàn)光下呈黃綠色，陰性對(duì)照為橘紅色。圖5中，HA和NA基因陽(yáng)性擴(kuò)增管在紫外光下可見(jiàn)熒光產(chǎn)生，陰性對(duì)照管內(nèi)無(wú)熒光產(chǎn)生?；厥誋A和NA 基因的陽(yáng)性產(chǎn)物，進(jìn)行普通PCR 擴(kuò)增后測(cè)序得知，擴(kuò)增序列與GISAID數(shù)據(jù)庫(kù)中的H7N9序列一致，表明LAMP方法特異性的擴(kuò)增檢測(cè)H7N9病毒的HA基因和NA基因。

圖3 LAMP擴(kuò)增電泳結(jié)果

圖4 LAMP擴(kuò)增可見(jiàn)光結(jié)果

圖5 LAMP擴(kuò)增紫外光結(jié)果

2.4 HA和NA基因的靈敏度試驗(yàn)

取陽(yáng)性質(zhì)粒DNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，10倍系列稀釋后，進(jìn)行H7N9禽流感病毒HA和NA基因的靈敏度檢測(cè)試驗(yàn)。圖6和圖7中所示H7N9 禽流感病毒HA和NA 基因10 拷貝以上的稀釋度均顯示了典型的LAMP 擴(kuò)增帶型，說(shuō)明該檢測(cè)方法的靈敏度可達(dá)到10 個(gè)拷貝的水平。

2.5 特異性試驗(yàn)

分別以H1型、H3型、H5型禽流感病毒和新城疫病毒（NDV）核酸作為待測(cè)樣品，以所提取的H7N9亞型禽流感病毒質(zhì)粒DNA為陽(yáng)性對(duì)照，以經(jīng)DEPC處理的水為陰性對(duì)照，檢驗(yàn)方法的特異性。結(jié)果如圖8所示，陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照均成立，以H7N9亞型禽流感病毒所構(gòu)建的質(zhì)粒DNA呈陽(yáng)性，其他試驗(yàn)樣品呈陰性，表明試驗(yàn)所用引物對(duì)H7N9亞型禽流感病毒特異性良好。

圖6 HA基因檢測(cè)靈敏度

圖7 NA基因檢測(cè)靈敏度

圖8 特異性試驗(yàn)

圖9 熒光定量PCR在H7N9禽流感病毒檢測(cè)中的靈敏度測(cè)試

2.6 熒光定量PCR與所建立的LAMP方法的對(duì)比

分別以熒光定量PCR方法和LAMP方法檢測(cè)構(gòu)建好的陽(yáng)性重組質(zhì)粒，熒光定量PCR方法檢測(cè)結(jié)果如圖9所示，靈敏度達(dá)到10個(gè)拷貝水平，與所建立的LAMP方法檢測(cè)靈敏度相同。

3 討論

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（ LAMP） 是一種新的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，原理是在目的基因片段上的多個(gè)位點(diǎn)上設(shè)計(jì)4條或6條引物，通常只要4條引物即可完成目的基因的擴(kuò)增，如果加入另外兩條環(huán)引物，可以有效的加速整個(gè)反應(yīng)過(guò)程，但反應(yīng)體系內(nèi)引物的增多也會(huì)增加引物二聚體的形成。LAMP 反應(yīng)結(jié)果判別方法多樣， 目前常用的有電泳法、熒光法、濁度法和鈣黃綠素法[7]。濁度法和鈣黃綠素法是基于LAMP 反應(yīng)產(chǎn)生的大量焦磷酸鹽副產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)的方法， 因此這2種方法均存在一定程度的背景干擾，且干擾強(qiáng)度隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)而增加[8]；電泳法和熒光法利用雙鏈嵌合染料直接檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，因此背景更低，其中熒光法的陽(yáng)性、陰性可用肉眼區(qū)分，對(duì)操作人員的技術(shù)要求低，更適合于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)[9]。

本文采用LAMP技術(shù)建立了檢測(cè)H7N9亞型禽流感病毒核酸的檢測(cè)方法， 通過(guò)與中國(guó)疾控中心推薦的H7N9亞型禽流感病毒實(shí)時(shí)熒光RT - PCR 法相比較，兩種方法的檢測(cè)靈敏度相當(dāng)，將106復(fù)制的病毒量質(zhì)粒進(jìn)行10倍系列稀釋后，實(shí)時(shí)RT- PCR 檢測(cè)和本文建立的LAMP方法檢測(cè)靈敏度均為10個(gè)拷貝；從檢測(cè)時(shí)間上看LAMP完成1次檢測(cè)可在1.5h內(nèi)完成，而實(shí)時(shí)RT- PCR法則需要3h。從所需儀器上看實(shí)時(shí)RT - PCR 需要熒光定量PCR 儀，而LAMP只需恒溫水浴鍋。

綜上所述，本研究建立的H7N9亞型禽流感病毒核酸LAMP檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、方便快捷等特點(diǎn)，可在基層或小型實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行，同時(shí)也可應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)、衛(wèi)生評(píng)價(jià)、臨床診斷等方面，為H7N9亞型禽流感病毒檢測(cè)提供了一種新的技術(shù)與方法。

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