丁聰聰 姜曉萍 (廣東醫(yī)學(xué)院中美聯(lián)合腫瘤研究所，廣東 東莞 523808)

宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)是一組與宮頸浸潤密切相關(guān)的癌前期病變，反映了宮頸癌(CC)發(fā)生中連續(xù)發(fā)展的過程，CIN的早期篩查、診斷能有效降低CC的發(fā)病率。因此，臨床上迫切需要一種可靠的指標以早期發(fā)現(xiàn)CIN，阻止其向浸潤性癌方向發(fā)展〔1〕。本研究采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)和重復(fù)片段擴增方法銀染定性法(TRAP-PCR)，對所有樣本宮頸組織中人端粒酶基因(hTERC)和人乳頭瘤病毒(HPV16/18)的感染和表達情況進行檢測，以期了解HPV16/18和hTERC的表達與CIN和CC的關(guān)系，旨在為CIN和CC早期診斷提供新的指標。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選擇2010年1月至2012年1月我院收治的CIN和CC患者各30例。30例CIN病例年齡45～57〔平均(49.6±6.4)〕歲，其中CINⅠ10例，CINⅡ9例，CINⅢ 11例;30例CC病例均為浸潤性CC(ICC)，年齡55～65〔平均(57.8±5.8)〕歲。所有CIN和CC病例均符合國家衛(wèi)生部發(fā)布的《子宮頸癌診斷》關(guān)于CIN和ICC的診斷標準〔2〕，并經(jīng)細胞學(xué)檢查和陰道鏡檢查確診。隨機選擇同時期在本院門診就診的宮頸正常30例病理標本作為對照，年齡55～67〔平均(60.1±5.9)〕歲。所有病例均未接受過放療或化療、宮頸和子宮切除手術(shù)和服用過激素類藥物治療。各組病例在年齡等各方面具有均衡性(P＞0.05)。同時，研究前均告知患者或其家屬，并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 組織標本采集 用薄層液基細胞學(xué)宮頸刷插入宮頸口，取病例宮頸的新鮮組織，立即用無菌雙蒸水洗滌，將洗滌后的組織用手術(shù)刀片盡可能切碎，置入1.5 ml無菌離心管內(nèi)。

1.2.2 HPV16/18 PCR擴增和電泳檢測 分別采用QIA Mini試劑盒(QIAGEN，美國)和病毒核酸試劑盒(Roche，德國)提取宮頸組織中HPV16/18 DNA模板。采用PCR擴增反應(yīng)和聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳對患者血中HPV DNA進行檢測。以HPV16/18 DNA模板，利用PCR擴增反應(yīng)對所有90個病例的血液DNA提取物進行擴增，擴增程序如下:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性40 s，60℃退火 35 s，72℃延伸 45 s，重復(fù) 30循環(huán);72℃延伸5 min 1個循環(huán);4.0℃保存。在10%非變性PAGE上電泳檢測擴增產(chǎn)物，銀染觀察結(jié)果。擴增的引物序列HPV16為前向:5'TTATTTTGAGCTTTGGTTCTG3';反向:5'CCCGCTTTC GTAGTTTCAT3';HPV18為前向:5'TGCAGCACGAATAAGGCACTGGCCTC3';反向:5'CACGGCGACCCTACAAGCTACGG3'，由上海生工合成。HPV 16的陽性擴增片段大小為184 bp，而HPV 18的陽性擴增片段為154 bp。

1.2.3 hTERC PCR擴增和電泳檢測 hTERC擴增模板參照虞偉等〔3〕公布的方法。采用TRAP和PAGE電泳對患者組織中hTERC DNA進行檢測。擴增程序同上，引物序列為TS:5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3';CX:5'-CCCTTACCCTTACCCTTAC CCTAA-3'。凡在凝膠電泳上顯示相隔6 bp的梯狀條帶，表示樣本為hTERC陽性，陰性表達者僅出現(xiàn)一條35 bp內(nèi)對照條帶，條帶的深淺表示hTERC活性的大小。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析，計數(shù)數(shù)據(jù)采用χ2檢驗，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析，關(guān)聯(lián)分析采用Logistic回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 HPV16/18 PAGE電泳檢測結(jié)果 分別從ICC、CINⅠ～Ⅲ和正常宮頸病例中隨機選取4例進行HPV16/18的PCR擴增和電泳檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ICC、CINⅢ、CINⅡ、CINⅠ組和正常宮頸病例HPV16陽性條帶檢測數(shù)分別為4、4、3、2和0條。而ICC、CINⅢ、CINⅡ、CINⅠ和正常宮頸病例HPV18陽性條帶檢出數(shù)分別為4、3、2、2 和0 條。見圖1，圖2。

圖1 HPV 16 DNA檢測圖譜

圖2 HPV 18 DNA檢測圖譜

2.2 hTERC聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結(jié)果 從ICC、CINⅠ～Ⅲ和正常宮頸病例中隨機選取2例進行hTERC的擴增和電泳檢測，ICC、CINⅢ、CINⅡ、CINⅠ和正常宮頸病例出現(xiàn)相隔6 bp的梯狀條帶的例數(shù)分別為2、2、2、2和0條。同時顯示hTERC擴增條帶亮度從ICC、CINⅢ、CINⅡ、CINⅠ依次減弱。見圖3。

圖3 hTERC聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測TRAP銀染結(jié)果

2.3 各組患者 HPV16/18陽性率比較 ICC HPV16/18陽性感染率極顯著高于CIN組和正常宮頸組(P＜0.01)，而CIN組HPV16/18陽性感染率顯著高于正常宮頸組(P＜0.05)。CINⅢ、CINⅡ和CINⅠ組間比較，CINⅢ HPV16/18陽性感染率極顯著高于CINⅡ和CINⅠ組(P＜0.05)，CINⅡ HPV16/18陽性感染率極顯著高于CINⅠ組(P＜0.05)。見表1。

表1 各組患者HPV16/18陽性率統(tǒng)計結(jié)果〔n(%)〕

2.4 各組患者hTERC陽性率比較 ICC、CIN以及正常宮頸癌組hTERC陽性率分別為93.33%28例、53.33%(16例)和3.33%(1例)。ICC hTERC陽性感染率〔8例(72.72%)〕極顯著高于CIN組和正常宮頸組(P＜0.01)，而CIN組hTERC陽性感染率顯著高于正常宮頸組(P＜0.05)〔8例(72.72%)〕。CINⅢ、CINⅡ和CINⅠ組間比較，CINⅢ 組hTERC陽性感染率極顯著高于 CINⅡ〔5例(55.56%)〕和 CINⅠ組〔3例(30.0%)〕(P＜0.05)，CINⅡ組hTERC陽性感染率極顯著高于CINⅠ組(P＜0.05)。

2.5 HPV16/18和hTERC陽性率與CIN和ICC易感性關(guān)聯(lián)分析 CIN和ICC易感性與HPV16/18和hTERC陽性率存在顯著關(guān)聯(lián)性，其中ICC和CINⅢ與HPV16/18和hTERC陽性存在顯著正相關(guān)(P＜0.05)。而正常宮頸組織與 HPV16/18和hTERC陽性率不存在關(guān)聯(lián)性(P＞0.05)。見表2。

表2 HPV16/18和hTERC陽性與CIN和ICC易感性

3 討論

20世紀70年代末，Hausen首次提出CC的HPV病因假說，認為CC與HPV16和18等高危型HPV的持續(xù)感染相關(guān)。HPV是一種雙鏈DNA病毒，具有球形外殼，可以寄生于受損的宮頸上皮，使宮頸處于持續(xù)感染狀態(tài)，導(dǎo)致宮頸上皮發(fā)生不典型增生，引起不同程度上皮瘤變，繼而發(fā)生CC〔4〕。近年來，國內(nèi)外眾多研究證實高危型HPV 16、18等亞型與CC發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。梅佳等〔5〕研究認為HPV感染與CIN變呈正相關(guān)，是CIN早期篩查的理想手段。周斌等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)高危型 HPV 16/18感染與CC及CC癌前病變的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，HPV 16/1 8 DNA檢測敏感性高于液基細胞學(xué)，對宮頸炎等良性病變的陰性預(yù)測值高于液基細胞學(xué)。Cogliano等〔7〕研究認為宮頸HPV感染的檢測結(jié)合其他輔助檢查，對預(yù)防CC的發(fā)生有一定的意義，并具有進一步的推廣和應(yīng)用價值。Carozzi等〔8〕發(fā)現(xiàn)HPV16/18可更早發(fā)現(xiàn)CC和癌前病變，并對宮頸病變干預(yù)和治療具有重要的指導(dǎo)意義。

本研究數(shù)據(jù)表明高危型HPV16/18與CIN和ICC的發(fā)病率存在密切關(guān)聯(lián)性，可以通過檢測患者宮頸組織中HPV16/18來早期診斷患 CC，這與梅佳等〔5〕和 Carozzi等〔8〕的研究結(jié)果一致。雖然高危型HPV16/18檢測敏感性高，但特異性一般只有64% ～95%，尤其是年輕性生活活躍的婦女，許多HPV感染是暫時的，并不會導(dǎo)致CC的發(fā)生。細胞學(xué)篩查也僅是通過細胞學(xué)特征進行診斷，缺少組織結(jié)構(gòu)特征，敏感性低，因而在診斷中也不可避免地出現(xiàn)一定的漏診或誤診。高危型HPV16/18檢測均不能同時達到較高的敏感性和特異性。因此，需要尋找其他更準確、更可靠、更有預(yù)見性的方法，以彌補上述監(jiān)測指標的不足〔9〕。

現(xiàn)代細胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究表明，CC的發(fā)生與人類3號染色體長臂的增加密切相關(guān)，其中涉及的最重要基因是人染色體hTERC，它可以阻止細胞凋亡，導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生。因此，hTERC基因的異常擴增是 CC發(fā)生的早期事件，檢測hTERC的擴增有助于 CC的篩查及早期診斷〔10〕。近年來，hTERC與CC關(guān)系的研究也成為熱點，它已成為目前已知最為廣譜的惡性腫瘤的分子標志物。趙繼紅等〔11〕采用TRAP-PCR，發(fā)現(xiàn)正常宮頸組織與CC癌變組織hTERC活性存在顯著差異，認為hTERC在CC發(fā)生中可能起到重要作用，檢測子宮頸病變中hTERC，對探討宮頸病變的進展和CC的發(fā)生具有重要意義。賀昕紅〔12〕采用熒光原位雜交方法，檢測60例子宮頸脫落細胞hTERC的表達情況，發(fā)現(xiàn)hTERC基因的陽性表達與CC病變程度密切相關(guān)，提示在其發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用，hTERC基因檢測有望成為CC早期篩查方法之一。Alamed等〔13〕研究認為檢測hTERC基因擴增有望成為協(xié)助預(yù)測宮頸病變進展的重要標記物，并可能減少病理組織形態(tài)學(xué)篩查的假陰性或漏診情況。Heselmeyer等〔14〕采用TRAP檢測CC患者，發(fā)現(xiàn)hTERC在CC組織中高度表達。以上大量研究結(jié)果均顯示，活化與CC的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。本研究也表明CC和hTERC活性存在極其顯著的相關(guān)關(guān)系，可以通過檢測患者宮頸組織中hTERC活性來判定是否患CC。

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