張 力 李毅學(xué) 張立廣 何瑞龍 (承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院放療科，河北 承德 067000)

研究表明，腫瘤細(xì)胞對于高溫的敏感性明顯高于正常細(xì)胞，高熱治療惡性腫瘤是近年來國內(nèi)外迅速推廣的一種治療癌癥的新方法，并已顯出良好的療效〔1，2〕。近年來，隨著熱療理論和技術(shù)的發(fā)展，將熱療與手術(shù)等其他常規(guī)治療方法聯(lián)合應(yīng)用可在腫瘤治療中發(fā)揮協(xié)同作用〔3〕。盡管熱療在腫瘤綜合治療中得到廣泛運(yùn)用，但有關(guān)熱療的理論研究相對滯后，其分子生物學(xué)機(jī)制的探討尚不深入。本研究觀察熱療不同時間誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞株HepG2凋亡的效果，并初步探討其可能的機(jī)制，從而為臨床應(yīng)用提供可靠的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 RPMI1640培養(yǎng)基(GIBCO公司)，肝癌細(xì)胞株HepG2、AnnexinⅤ-EGFP凋亡試劑盒(南京凱基生物科技有限公司)，Bax，Bcl-2 RT-PCR引物是由上海生物工程有限公司設(shè)計(jì)，Trizol試劑、RT-PCR試劑盒、DNA MarkerDL1000購自大連寶生物公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株HepG2:為單層貼壁生長，置于培養(yǎng)液為RPMI1640培養(yǎng)基，內(nèi)含10%新生牛血清，100 μ/ml青霉素，100 μg/ml鏈霉素，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至指數(shù)生長期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，隔2～3 d傳代一次，細(xì)胞消化液為0.25%的胰酶。按每瓶5 μl(1×104)細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后(細(xì)胞已貼壁)，用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與處理方法 對照組:不做任何處理，一直在培養(yǎng)箱內(nèi)。熱療組:隨機(jī)取12瓶細(xì)胞，分別置于溫度為(43±0.1)℃水浴箱內(nèi)，分別加熱0.5，1，1.5 h再放回37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.4 AnnexinⅤ/PI雙染法流式細(xì)胞儀檢測肝癌細(xì)胞凋亡率取各組 HepG2細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，1 000 r/min離心10 min，棄上清。加入1 ml冷的PBS，輕輕震蕩使細(xì)胞懸浮，重復(fù)上述步驟。將細(xì)胞重懸于250 μl上樣緩沖，加入10 μl AnnexinⅤ-EGFP 和 5 μl PI，輕輕混勻，室溫避光反應(yīng) 15 min，上機(jī)檢測。自動檢測出肝癌細(xì)胞凋亡率。結(jié)果判定:AnnexinⅤ－/PI－為正常細(xì)胞，AnnexinⅤ +/PI-為凋亡細(xì)胞，AnnexinⅤ +/PI+為壞死細(xì)胞。

1.5 RT-PCR檢測肝癌細(xì)胞Bax，Bcl-2 mRNA的表達(dá) 收集細(xì)胞，應(yīng)用Trizol提取細(xì)胞總RNA，提取的RNA樣品用無RNase污染的水溶解，測定260/280 nm吸光度值，瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示所提RNA完整性。按照通用型RT-PCR試劑盒進(jìn)行具體操作。Bax基因的引物序列上游:5'ACCAAGAAGCTGAGCGAGTGTC3'，下 游:5'GGCAGACCGTGACCATCTTTGT3'，擴(kuò)增產(chǎn)物365 bp;Bcl-2基因的引物序列上游:5'TGCACCTGACGCCCTTCAC3'，下 游:5'AGACAGCCAGGAGAAATCAAACAG3'，擴(kuò)增產(chǎn)物 293 bp;β-actin上游引物:5'TTCATTGACCTCAACTACAT3'，下游引物 5'GAGGGGCCATCCACAGTCTT3'，擴(kuò)增產(chǎn)物 467 bp。PCR 擴(kuò)增 Bax:94℃ 3 min，94℃ 40 s，58℃50 s，72℃ 2 min，72℃ 10 min，30 個循環(huán);Bcl-2:94℃ 3 min ，94℃ 40 s，59℃ 50 s，72℃ 1 min，72℃ 10 min，30 個循環(huán);內(nèi)參照 β-actin:94℃ 3 min ，94℃ 40 s，56℃ 40 s ，72℃ 1 min，72℃3 min，30個循環(huán)。將產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳，恒壓120 V，30 min，UVP成像分析系統(tǒng)拍照觀察。用Quantity One軟件進(jìn)行灰度分析，計(jì)算目的基因條帶與內(nèi)參照β-actin的灰度比值。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞儀檢測AnnexinV-EGFP標(biāo)記的肝癌細(xì)胞凋亡情況 與正常對照組肝癌細(xì)胞凋亡率(5.94±0.17)%相比，熱療0.5，1，1.5 h 3個組肝癌細(xì)胞凋亡率分別為(11.10±0.33)%，(17.06±0.98)%，(12.43±0.53)%明顯增加(P＜0.01)，提示熱療可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡。

2.2 熱療對肝癌細(xì)胞中Bax mRNA表達(dá)的影響 RT-PCR結(jié)果顯示，正常對照組Bax與其對應(yīng)的β-actin mRNA條帶灰度值的比值為(0.45±0.05);與正常對照組相比，熱療0.5，1，1.5 h 3個組肝癌細(xì)胞Bax與其對應(yīng)的β-actin mRNA條帶灰度值的比值分別為(1.05±0.05，1.51±0.04，0.82±0.04)，較正常對照組增加(P＜0.01)以加熱1 h組最明顯，并且Bax/Bcl-2增加(P＜0.01)。見圖1。

圖1 熱療對肝癌細(xì)胞中Bax mRNA表達(dá)的影響

2.3 熱療對肝癌細(xì)胞中Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響 RT-PCR結(jié)果顯示，正常對照組Bcl-2與其對應(yīng)的β-actin mRNA條帶灰度值的比值為(2.19±0.04);與正常對照組相比，熱療0.5，1，1.5 h 3個組肝癌細(xì)胞Bcl-2與其對應(yīng)的β-actin mRNA條帶灰度值的比值分別為(1.39±0.03，0.92±0.05，1.51±0.03)，較正常對照組降低(P＜0.01)，以加熱1 h組最明顯。見圖2。

圖2 熱療對肝癌細(xì)胞中Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響

3 討論

原發(fā)性肝癌系全球發(fā)病率和死亡率均較高的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害人類健康。除部分早期患者可進(jìn)行手術(shù)治療外，近年來熱療作為一種輔助治療方法〔4〕，和其他腫瘤治療方法聯(lián)合進(jìn)行逐漸成為腫瘤治療發(fā)展趨勢。例如與化療聯(lián)合應(yīng)用可產(chǎn)生互補(bǔ)作用，可增加化療藥物的敏感性，可改善、提高對于抗藥性腫瘤的治療效果〔5〕。熱療可選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞，而對正常細(xì)胞沒有影響。根據(jù)治療溫度的不同，可以將熱療大致分為高溫?zé)岑?＞43℃)、低溫?zé)岑?≤43℃)兩類;高溫?zé)岑熆墒拱胁课患?xì)胞因蛋白質(zhì)變性而直接死亡，低溫?zé)岑焺t通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等達(dá)到治療目的〔6，7〕。已有許多實(shí)驗(yàn)證實(shí)，加熱 43℃30 min，可以引起廣泛的細(xì)胞凋亡〔8〕。

目前認(rèn)為，肝癌的發(fā)生發(fā)展除了與細(xì)胞的增殖失控和細(xì)胞分化異常有關(guān)外，另一個重要原因是發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞不能正常凋亡。近年來細(xì)胞凋亡在熱療中的重要作用引起了廣泛關(guān)注。研究表明，不同種類細(xì)胞株的臨界溫度不一，差異很大〔9〕。Vorotnikonva等〔10〕報(bào)道大腸癌細(xì)胞暴露于40℃ 45 min后100%細(xì)胞凋亡，溫度提高至42℃后，細(xì)胞壞死增加，凋亡減少。Rong等〔11〕報(bào)道Dunn骨肉瘤細(xì)胞在43.5℃持續(xù)1 h加溫后即可產(chǎn)生凋亡細(xì)胞。本研究用43℃分別加溫肝癌HepG2細(xì)胞0.5，1，1.5 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)熱療可以使HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡，且以加溫1 h HepG2細(xì)胞凋亡最多。

細(xì)胞凋亡是多基因調(diào)控下按一定程序進(jìn)行的細(xì)胞主動死亡，具有非常重要的意義。Bcl-2家族是目前最受重視的調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因家族，它們可以分為兩大類，即凋亡抑制基因(Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W 等)及凋亡誘導(dǎo)基因(Bax、Bcl-xs、Bad、Bid等)，兩者間的相互作用決定細(xì)胞的生存與凋亡。其中研究最多是Bcl-2和Bax基因，其也是調(diào)控細(xì)胞凋亡的主要分子。Bcl-2基因/蛋白過量表達(dá)，細(xì)胞存活，Bax基因/蛋白過量表達(dá)，則促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔12，13〕。本實(shí)驗(yàn)表明加熱作為一種外來刺激信號，可以通過調(diào)節(jié)HepG2細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因Bax和Bcl-2的基因表達(dá)，來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Bax與Bcl-2可形成異源二聚體，細(xì)胞中Bax高表達(dá)時形成Bax同源二聚體，加速細(xì)胞凋亡;相反，Bcl-2高表達(dá)時，形成Bcl-2異源二聚體，抑制細(xì)胞凋亡，也就是Bax與Bcl-2相互作用可能還是以兩者間的比值來決定細(xì)胞的生存與凋亡。

總之，熱療在體外能顯著增加肝癌胞株HepG2的凋亡率，其機(jī)制可能與上調(diào)Bax基因表達(dá)、下調(diào)Bcl-2基因的表達(dá)，增加Bax/Bcl-2的比值有關(guān)。這將為臨床應(yīng)用熱療治療肝癌提供部分理論依據(jù)。

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