劉飛飛 楊安幫 溫豐標(biāo) 劉東雷 楊 洋 吳 愷 趙 松

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科，河南 鄭州 450052)

化療和放療在腫瘤細(xì)胞內(nèi)可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬〔1〕。順鉑(DDP)是肺癌化療常用的藥物之一，通過(guò)干擾DNA復(fù)制誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，還能促進(jìn)細(xì)胞自噬性死亡，但癌細(xì)胞容易對(duì)其產(chǎn)生耐藥性，因此，如何提高DDP誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡能力，增加癌細(xì)胞對(duì)其敏感性是困擾臨床急需解決的問(wèn)題。相關(guān)研究認(rèn)為自噬是化療藥物作用機(jī)制之一，可能在耐藥性中發(fā)揮一定作用〔2〕。本研究通過(guò)DDP誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡，再聯(lián)合自噬抑制劑三甲基腺嘌呤(3－MA)，探討抑制自噬對(duì)DDP誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 肺癌A549細(xì)胞由河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室提供;3－MA、Hoechst33342熒光染料、二甲基亞砜(DMSO)、單丹黃酰尸胺(MDC)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)購(gòu)于Sigma公司。DDP購(gòu)于山東齊魯制藥有限公司。胎牛血清購(gòu)于杭州四季青生物工程材料有限公司。無(wú)血清細(xì)胞凍存培養(yǎng)基(RPMI1640)、不含乙二胺四乙酸(EDTA)胰蛋白酶、4%多聚甲醛購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司。Annexin6異氰酸熒光素/碘化丙啶(V－FITC/PI)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2、濕度飽和的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞，每3 d更換一次培養(yǎng)液，用胰酶混合液(含0.02%EDTA和0.25%胰酶)消化細(xì)胞進(jìn)行傳代或?qū)嶒?yàn)操作。實(shí)驗(yàn)分為不加藥物干預(yù)的對(duì)照組、3－MA組、DDP組、3－MA和DDP聯(lián)合作用組(同時(shí)加入DDP和3－MA)。

1.2.2 MTT法檢測(cè)藥物最適濃度和作用時(shí)間 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行消化制成細(xì)胞懸液，以1×105個(gè)/ml濃度接種于96孔板，每孔150 μl，培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)液，分別加入一系列濃度梯度的DDP及3－MA，每孔加入150 μl，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組加入等體積培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2、濕度飽和的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72 h。然后每孔加入濃度為5 g/L的四唑鹽(MTT)20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，然后每孔加入150 μl DMSO，振動(dòng)10 min，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)490 nm波長(zhǎng)的吸光度值，細(xì)胞抑制率=〔1－實(shí)驗(yàn)組A490 nm/對(duì)照組A490 nm〕×100%，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率 按上述方法于96孔板接種細(xì)胞培養(yǎng)24 h，按實(shí)驗(yàn)分組分別加入終濃度為10 mmol/L的3－MA和5 mg/L的DDP，分別設(shè)不加細(xì)胞的空白對(duì)照組、不加藥物的對(duì)照組，對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)液，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，置于37℃、5%CO2、濕度飽和的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后每孔加入濃度為5 g/L的MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，然后每孔加入150 μl DMSO，振動(dòng)10 min，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)490 nm波長(zhǎng)的吸光度值，細(xì)胞增殖率=實(shí)驗(yàn)組A490 nm/對(duì)照組A490 nm×100%，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 MDC染色檢測(cè)細(xì)胞自噬變化〔3〕用胰蛋白酶處理處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺癌A549細(xì)胞，以1×105個(gè)/ml濃度加入24孔板，待細(xì)胞貼壁后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組加入相應(yīng)濃度藥物作用24 h，棄培養(yǎng)液，用濃度為 50 μmol/L的 MDC在 37℃ 孵育60 min，PBS洗3次，用4%多聚甲醛4℃固定15 min，PBS洗3次，用倒置熒光顯微鏡觀察自噬空泡的變化情況并攝片，通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定不同組細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

1.2.5 Hoechst33342染色檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)變化 用胰蛋白酶消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，制成1×105個(gè)/ml細(xì)胞懸液，接種于24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，分別加入相應(yīng)濃度藥物作用24 h后，棄培養(yǎng)液，PBS沖洗2次，加入Hoechst33342(1 mg/L)避光對(duì)細(xì)胞染色，37℃孵育20 min，PBS沖洗2次，然后用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，并攝片，計(jì)算熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞百分比。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)消化制成1×105個(gè)/ml細(xì)胞懸液，接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，按實(shí)驗(yàn)分組加入相應(yīng)濃度藥物作用24 h，用不含EDTA的胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，PBS沖洗2次，按照 Annexin VFITC/PI試劑盒說(shuō)明書(shū)，室溫避光作用15 min，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用表示，采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法測(cè)定藥物最適濃度和作用時(shí)間 不同藥物濃度作用不同時(shí)間對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率影響不同。通過(guò)MTT法發(fā)現(xiàn)隨著3－MA和DDP濃度和作用時(shí)間增加，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率增加，當(dāng)3－MA作用24 h時(shí) IC10為10 mmol/L;當(dāng) DDP作用24 h時(shí)IC50為5 mg/L。因此，實(shí)驗(yàn)中選擇3－MA和DDP最終濃度分別為10 mmol/L和5 mg/L。

2.2 MA和DDP對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖的影響 單獨(dú)應(yīng)用3－MA對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響。單獨(dú)應(yīng)用DDP細(xì)胞增殖率明顯下降〔(49.7±2.4)%〕。3－MA和DDP組細(xì)胞增殖率〔(29.3±2.8)%〕與單獨(dú)應(yīng)用DDP相比明顯下降(P＜0.05)。

2.3 MDC染色檢測(cè)細(xì)胞自噬變化 由于MDC處理細(xì)胞后多聚集在自噬空泡中，在細(xì)胞核周?chē)梢?jiàn)到藍(lán)綠色或黃綠色點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)。單獨(dú)應(yīng)用3－MA作用于細(xì)胞未見(jiàn)明顯自噬空泡出現(xiàn)，流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞熒光強(qiáng)度為〔(97.8±7.1)%〕，與對(duì)照組熒光強(qiáng)度〔(81.1±9.1)%〕相比無(wú)明顯差異。單獨(dú)應(yīng)用DDP細(xì)胞染色質(zhì)凝聚，細(xì)胞中出現(xiàn)自噬空泡，熒光強(qiáng)度為(213.5±21.3)%，與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.05)，說(shuō)明在DDP作用下細(xì)胞發(fā)生自噬。3－MA與DDP聯(lián)合作用組與單獨(dú)應(yīng)用DDP組相比，自噬空泡減少，熒光強(qiáng)度明顯下降為(112.3±13.8)%，組間比較差異顯著(P＜0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 MDC染色檢測(cè)肺癌A549細(xì)胞自噬空泡的變化(×400)

2.4 Hoechst33342染色檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)變化 單獨(dú)應(yīng)用3－MA，細(xì)胞形態(tài)未見(jiàn)明顯變化，Hoechst33342染色陽(yáng)性細(xì)胞百分比為(3.1±0.9)%。單獨(dú)應(yīng)用DDP，細(xì)胞核裂解，染色質(zhì)凝聚，表明細(xì)胞發(fā)生凋亡，陽(yáng)性細(xì)胞百分比為(8.0±0.5)%。3－MA+DDP組細(xì)胞凋亡明顯增加，陽(yáng)性細(xì)胞百分比為(15.2±1.1)%，與單獨(dú)應(yīng)用DDP組相比差異顯著(P＜0.05)。見(jiàn)圖2。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 單獨(dú)應(yīng)用3－MA組細(xì)胞凋亡率為(3.2±0.8)%，與對(duì)照組`相比未見(jiàn)明顯差異。單獨(dú)應(yīng)用DDP組細(xì)胞凋亡率增加為(13.5±1.4)%，與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.05)。3－MA+DDP組細(xì)胞凋亡率明顯增加，為(23.6±2.1)%，與單獨(dú)應(yīng)用DDP組相比差異顯著(P＜0.05)，表明3－MA在促進(jìn)細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮一定作用。

3 討論

肺癌是當(dāng)今世界上最常見(jiàn)惡性腫瘤之一〔4〕。研究發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與自噬調(diào)控機(jī)制的失調(diào)有關(guān)。但有關(guān)自噬在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中所起的具體作用目前尚不完全清楚，研究發(fā)現(xiàn)自噬的作用可能與不同腫瘤細(xì)胞在不同時(shí)間所處的具體環(huán)境有關(guān)〔5〕。

DDP是一種可用于多種惡性腫瘤(包括肺癌)的廣譜化療藥物，可以抑制癌細(xì)胞的DNA復(fù)制過(guò)程，并損傷細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，但其腫瘤耐藥性一直是臨床治療難以克服的障礙〔6〕。有研究〔7～9〕表明DDP等藥物可以引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬，說(shuō)明自噬可能與腫瘤耐藥性存在一定的關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)自噬抑制劑3－MA能夠顯著增強(qiáng)順鉑對(duì)肺癌A549細(xì)胞的殺傷作用。MDC是分析自噬過(guò)程特異性自噬溶酶體標(biāo)記之一，通過(guò)MDC熒光染色可以發(fā)現(xiàn)DDP誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞發(fā)生自噬，而3－MA和DDP聯(lián)合作用降低了細(xì)胞的自噬水平。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3－MA和DDP聯(lián)合作用與單獨(dú)應(yīng)用DDP相比，細(xì)胞凋亡率明顯增高。綜合分析以上結(jié)果表明DDP可以誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞發(fā)生自噬和凋亡，抑制自噬可以增加細(xì)胞凋亡率，說(shuō)明自噬在DDP誘導(dǎo)的肺癌A549細(xì)胞凋亡的過(guò)程中可能起到保護(hù)作用。此外有研究表明在DDP誘導(dǎo)肺癌A549耐藥細(xì)胞株中，3－MA可以增加DDP抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡作用;并且認(rèn)為上調(diào)自噬在DDP誘導(dǎo)A549細(xì)胞耐藥機(jī)制中發(fā)揮主要作用〔7〕。而通過(guò)吖啶橙染色檢測(cè)自噬體的形成，在耐藥細(xì)胞中自噬體形成明顯減少，表明自噬能夠減少DDP誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡〔10〕。

本研究發(fā)現(xiàn)DDP可以誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞發(fā)生自噬。在化療過(guò)程中，通過(guò)抑制自噬表達(dá)，降低腫瘤細(xì)胞對(duì)受損細(xì)胞器的清除能力，增加腫瘤細(xì)胞的凋亡率，增加化療療效。

1 Zeng X，Kinsella TJ.Impact of autophagy on chemotherapy and radiotherapy mediated tumor cytotoxicity:to live or not to live〔J〕.Front Oncol，2011;1:30.

2 Rosenfeldt MT，Ryan KM.The role of autophagy in tumour development and cancer therapy〔J〕.Expert Rev Mol Med，2009;11:36.

3 Klionsky DJ，Abeliovich H，Agostinis P，et al.Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy in higher eukaryotes〔J〕.Autophagy，2008;4(2):151－75.

4 Spiro SG，Tanner NT，Silvestri GA，et al.Lung cancer:progress in diagnosis，staging and therapy〔J〕.Respirology，2010;15(1):44－50.

5 劉東雷，王建軍，楊 洋，等.自噬在順鉑誘導(dǎo)的食管癌細(xì)胞死亡中的作用〔J〕. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2010;27(9):1198－9.

6 K?berle B，Tomicic MT，Usanova S，et al.Cisplatin resistance:preclinical findings and clinical implications〔J〕.Biochim Biophys Acta，2010;1806(2):172－82.

7 Ren JH，He WS，Nong L，et al.Acquired cisplatin resistance in human lung adenocarcinoma cells is associated with enhanced autophagy〔J〕.Cancer Biother Radiopharm，2010;25(1):75－80.

8 Harhaji－Trajkovic L，Vilimanovich U，Kravic－Stevovic T，et al.AMPK－mediated autophagy inhibits apoptosis in cisplatin－treated tumour cells〔J〕.J Cell Mol Med，2009;13(9B):3644－54.

9 Claerhout S，Verschooten L，van Kelst S，et al.Concomitant inhibition of AKT and autophagy is required for efficient cisplatin－induced apoptosis of metastatic skin carcinoma〔J〕.Int J Cancer，2010;127(12):2790－803.

10 Sirichanchuen B，Penqsuparp T，Chanvorachote P.Long－term cisplatin exposure impairs autophagy and causes cisplatin resistance in human lung cancer cells〔J〕.Mol Cell Biochem，2012;364(1－2):11－8.