雷 陽， 李 羽， 王 彪， 李紅偉， 李 莉， 王錫鋒

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

由水稻條紋病毒（Rice stripe virus，RSV）引起的水稻條紋葉枯病是東亞稻區(qū)，尤其是中國(guó)、日本、韓國(guó)等的重要病毒病害，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［1］。曾經(jīng)于2001、2003、2004、2006和2008年在江蘇、山東、安徽、河南和上海等省份的粳稻種植區(qū)大規(guī)模暴發(fā)，2004年僅江蘇省的發(fā)病面積就達(dá)157萬hm2，占全省水稻種植面積的79%。流行年份，一般田塊減產(chǎn)20%～30%，嚴(yán)重田塊達(dá)到80%以上，甚至顆粒無收［2］。采取傳統(tǒng)治蟲防病策略對(duì)水稻條紋葉枯病有一定的防效，但大量使用化學(xué)農(nóng)藥既污染環(huán)境，也易使害蟲產(chǎn)生抗藥性，而且介體灰飛虱（Laodelphax striatellus Fallén）傳毒具有瞬時(shí)性和持久性，使得防病效果欠佳，因此防治病毒病最有效的途徑是通過增強(qiáng)品種自身的抗性，達(dá)到主動(dòng)預(yù)防病毒病害的目的。

RNA干擾（RNA interference，RNAi）機(jī)制的發(fā)現(xiàn)為植物抗病毒基因工程提供了一條全新的思路。RNAi是一種重要的基因沉默現(xiàn)象，可以通過雙鏈RNA（dsRNA）特異性降解對(duì)應(yīng)序列的 mRNA，從而特異性地抑制相應(yīng)基因的表達(dá)［3］。RNAi是一種古老的且進(jìn)化上高度保守的防御機(jī)制，但是通過長(zhǎng)期的共進(jìn)化，病毒已經(jīng)能夠從RNAi中逃逸，甚至產(chǎn)生抑制子來與之抗衡，植物體內(nèi)天然的RNAi系統(tǒng)不能起到完全或較高水平地抵御某種病毒侵染的作用。利用基因工程手段將病毒的某一序列設(shè)計(jì)成雙鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入植物體使之表達(dá)，以便誘發(fā)RNA沉默，就有可能強(qiáng)化植物體內(nèi)天然的RNA沉默病毒基因的能力。2007年代玉華等［4］構(gòu)建了RSV全長(zhǎng)CP基因RNAi載體，遺傳轉(zhuǎn)化水稻，獲得了穩(wěn)定遺傳、高抗或免疫的植株。2011年Shimizu等［5］將RSV編碼的7個(gè)基因都構(gòu)建成RNAi載體，分別導(dǎo)入水稻，接種試驗(yàn)表明：轉(zhuǎn)CP、SP基因的水稻植株對(duì)RSV免疫，轉(zhuǎn)pC1基因的水稻植株抗病性顯著提高，但轉(zhuǎn)pC2和pC4基因的水稻植株抗病性沒有增加。

在抗病基因工程中，外源基因整合到植物基因組中的頻率很低，一般從千分之幾到百萬分之幾不等［6］。為了便于篩選到低頻率的轉(zhuǎn)化事件，常將外源目的基因與易于識(shí)別的選擇標(biāo)記基因串聯(lián)，再通過標(biāo)記基因篩選低頻率的轉(zhuǎn)化事件。然而，使用選擇性標(biāo)記基因?qū)χ参锛?xì)胞的生長(zhǎng)和分化有不利的影響；對(duì)環(huán)境存在潛在危害，標(biāo)記基因可能轉(zhuǎn)移到土壤微生物和其他植物，引起其他生物產(chǎn)生抗性；在食品上有一定的安全風(fēng)險(xiǎn)和消費(fèi)心理障礙［7］。因此培育無選擇標(biāo)記基因的安全轉(zhuǎn)基因植物已成為植物基因工程發(fā)展的趨勢(shì)。

目前獲得無選擇標(biāo)記基因植物的方法主要有位點(diǎn)特異性重組、轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)和共轉(zhuǎn)化法等。位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)能精確地引入外源基因，但需要進(jìn)行二次轉(zhuǎn)化或雜交，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力［8］。利用轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)雖然能完整地刪除選擇標(biāo)記基因，但需要通過有性繁殖分離目的基因和標(biāo)記基因，周期長(zhǎng)、效率低，且不穩(wěn)定，難以定向優(yōu)化［9］。共轉(zhuǎn)化法具有操作簡(jiǎn)便，適用范圍廣，基因轉(zhuǎn)化效率較高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于水稻、煙草、油菜、大豆、玉米等植物中［10－12］。共轉(zhuǎn)化法就是把目的片段和選擇性擇標(biāo)記基因分別構(gòu)建于不同載體或同一載體的不同T－DNA區(qū)，期望借助于基因槍或農(nóng)桿菌介導(dǎo)等轉(zhuǎn)化方法將選擇標(biāo)記基因和目的基因同時(shí)導(dǎo)入同一受體細(xì)胞的不同染色體上。一方面利用選擇標(biāo)記基因編碼的性狀，篩選出同時(shí)含有目的基因的細(xì)胞或再生植株。另一方面，通過轉(zhuǎn)基因植株后代自交，使目的基因和選擇標(biāo)記基因發(fā)生分離，從而獲得不攜帶選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因陽性植株。雖然已有利用共轉(zhuǎn)化法培育無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因水稻的報(bào)道［13］，但由于RNA干涉載體片段大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，無抗性選擇標(biāo)記基因植株的獲得率還不盡如人意。本研究應(yīng)用RNAi原理，構(gòu)建了RSV CP基因（RSV－HCP）安全表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的雙菌、雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化法，對(duì)轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了優(yōu)化，成功獲得了轉(zhuǎn)基因再生植株，經(jīng)T1代自交分離、抗病性篩選，獲得了無選擇標(biāo)記基因的抗RSV植株。

1 材料與方法

1.1 轉(zhuǎn)基因受體、病毒分離物及傳毒介體材料

水稻模式品種‘愛知旭’（‘Aichiasahi’）以及對(duì)RSV高感、優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的品種‘武育粳3號(hào)’（‘Wuyujing 3’）和‘淮稻5號(hào)’（‘Huaidao 5’）用作轉(zhuǎn)基因的受體材料。

RSV分離物（RSV－JS）采集自江蘇南京自然發(fā)病的水稻（Oryza sativa Linnaeus）植株，經(jīng) ELISA和PCR鑒定、純化后保存在－70℃?zhèn)溆谩y帶RSV－JS的灰飛虱由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供，飼養(yǎng)在高感品種‘武育粳3號(hào)’上（26℃，14h光照）。

1.2 菌株和質(zhì)粒載體

大腸桿菌［Escherichia coli （Migula）Castellani et Chalmers］JM110、根瘤農(nóng)桿菌 ［Agrobacterium tumefaciens（Smith Townsend）Conn］EHA105和RNAi載體pMCG161均為本實(shí)驗(yàn)室保存。載體pCAMBIA1301為澳大利亞CAMBIA中心產(chǎn)品，本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 載體構(gòu)建

1.3.1 目的基因的克隆

按照已公布 RSV CP基因序列（GenBank.DQ299166.1）設(shè)計(jì)引物。上游引物 RSV－HCP－F：5′－AGACTAGT GGCGCGCCGACTATGTGCATCACCATGAG－3′，引入限制性酶切位點(diǎn)SpeⅠ和AscⅠ；下 游 引 物 RSV－HCP－R：5′－AGGAGCTCCCTAGGACAGCCATCTTAACACCAG－3′，引 入酶切位點(diǎn)SacI和Av rⅡ，預(yù)期擴(kuò)增片段約256bp。

采用Trizol法（Invitrogen）提取水稻葉組織的總RNA為模板，以RSV－HCP－R為引物合成第一鏈cDNA。再以合成的cDNA為模板，以RSVHCP－F和RSV－HCP－R為引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)總體積50μL（模板100ng，dNTP 1mmol／L，聚合酶5U，RSV－HCP－F 0.5μmol／L，RSV－HCPR 0.5μmol／L），反應(yīng)條件：94℃4min；94℃40s，52℃40s，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。將擴(kuò)增到的RSV－CP基因部分片段命名為RSVHCP。試驗(yàn)以健康植株為陰性對(duì)照。將RSV－HCP克隆于pMD18－T載體，經(jīng)驗(yàn)證序列正確的重組質(zhì)粒命名為pMD18－T－HCP（基因的測(cè)序工作由上海生物工程公司完成）。

1.3.2 無潮霉素抗性基因載體pCMBIA1301－h(huán)pt（－）的獲得

用限制性內(nèi)切酶XhoI酶切載體pCMBIA1301，經(jīng)電泳檢測(cè)、回收、純化大片段，再經(jīng)T4DNA連接酶16℃連接過夜，即可得到去除潮霉素標(biāo)記基因的pCMBIA1301載體，經(jīng)PCR和酶切驗(yàn)證的載體命名為pCMBIA1301－h(huán)pt（－）。

1.3.3 RSV－HCP基因RNAi載體的構(gòu)建

選擇含有來源于水稻Intron的RNAi載體pMCG161，通過酶切、T4連接酶作用，將RSV－HCP正向片段插入在載體的酶切位點(diǎn)Asc I、AvrⅡ間，將反向片段插入在載體的Spe I、Sac I間，獲得RNAi載體pMCG161＋／－R。由于該載體含有氯霉素抗性基因，不適合根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，因此將中間載體pMCG161＋／－R上的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，用BamH I、HindⅢ雙酶切，回收6920bp的片段，在T4DNA連接酶作用下，與同樣經(jīng)BamH I、HindⅢ酶切的載體pCMBIA1301－h(huán)pt（－）連接（16 ℃過夜），得到無潮霉素標(biāo)記基因的RNAi載體，以antisense IP 5′（5′－TTCCTGGGCTAAAAGAATTGTTGATTTGGC－3′）和 antisense IP 3′（5′－CCGGTTCTGCCGCTTTTTTTAAAATTGGAT－3′）為 引物對(duì)，進(jìn)行PCR鑒定，正確的質(zhì)粒命名為pCMBIA1301＋／－R。

利用電擊法將質(zhì)粒pCMBIA1301＋／－R和pCAMBIA1301分別轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞中，得到的陽性重組子分別命名為E13R和 E1301［10］。

1.4 不同水稻品種對(duì)共轉(zhuǎn)化率的影響

分別將水稻品種‘愛知旭’、‘武育粳3號(hào)’和‘淮稻5號(hào)’的成熟種子滅菌后置于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，28℃黑暗培養(yǎng)10～15d。剝下成熟胚盾片長(zhǎng)出的愈傷組織，進(jìn)行繼代培養(yǎng)，每個(gè)品種各取長(zhǎng)勢(shì)良好的愈傷900個(gè)，分為3個(gè)重復(fù)。將E13R和E1301分別在YM培養(yǎng)基（酵母膏0.3%，胰蛋白胨0.5%，麥芽糖0.5%，pH＝9.0；Kana 50μg／mL；利福平50μg／mL）平板上劃線，28℃黑暗培養(yǎng)2～3d，挑取單菌落，220r／min振蕩培養(yǎng)。當(dāng)A600至0.8時(shí)，4000r／min離心收集菌體，用AAM＋100μmol／L AS培養(yǎng)基重新懸浮沉淀至A600為0.4。將E13R和E1301的懸浮液按照體積比為1∶1混合，分別對(duì)3個(gè)水稻品種共轉(zhuǎn)化。水稻愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)、與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)、抗性愈傷組織的篩選再生及所用培養(yǎng)基配方等參照易自立［11］的方法。對(duì)T0代再生植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，分別統(tǒng)計(jì)出抗性愈傷數(shù)、苗數(shù)和陽性植株數(shù)，并計(jì)算出愈率、再生率和共轉(zhuǎn)化率。計(jì)算公式如下：

1.5 不同菌液配比對(duì)共轉(zhuǎn)化率的影響

將E13R和E1301的懸浮液按照體積比3∶1、2∶1、1∶1和1∶2混合，以水稻品種‘愛知旭’為受體，分別進(jìn)行共轉(zhuǎn)化。對(duì)T0代再生植株進(jìn)行PCR檢測(cè)后，分別統(tǒng)計(jì)出抗性愈傷數(shù)、苗數(shù)和陽性植株數(shù)，并計(jì)算出愈率、再生率和共轉(zhuǎn)化率。

1.6 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)

以改進(jìn)的CTAB法［14］提取轉(zhuǎn)基因植株幼嫩葉組織總DNA，采用兩重PCR反應(yīng)體系，同時(shí)擴(kuò)增RSV－HCP和hptⅡ基因。反應(yīng)總體積50μL（模板100ng，dNTP 1mmol／L，聚合酶5U，RSV－HCP－F 0.3 μmol／L，RSV－HCP－R 0.3 μmol／L，N－h(huán)pt－F 0.3μmol／L，N－h(huán)pt－R 0.3μmol／L），反 應(yīng) 條 件 同1.3.1節(jié)，預(yù)期PCR產(chǎn)物RSV－HCP片段為265bp，hptⅡ基因片段為1042bp。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。hptⅡ擴(kuò)增引物對(duì)為N－h(huán)pt－F和N－h(huán)pt－R。引 物 N－h(huán)pt－F 序 列 為 5′－CCCATGGGATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGAC－3′，N－h(huán)pt－R為5′－CCCATGGGCTATTTCTTTGCCCTCGGACGAGTGC－3′。

1.7 轉(zhuǎn)基因植株的抗病性分析

對(duì)水稻條紋葉枯病的抗性鑒定試驗(yàn)在本所防蟲溫室內(nèi)進(jìn)行（溫度26～30℃，光照14h），以‘鎮(zhèn)稻88’為抗病對(duì)照，‘武育粳3號(hào)’為感病對(duì)照，管理按常規(guī)方法進(jìn)行。接種和調(diào)查方法參照張世賢等［15］，水稻條紋葉枯病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照盧百關(guān)等［16］。

1.8 數(shù)據(jù)處理

以ANOVA／MANOVA統(tǒng)計(jì)方法分析數(shù)據(jù)，并進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNAi載體的構(gòu)建

2.1.1 RSV CP基因部分核苷酸片段的克隆

以水稻葉組織總RNA為模板，以RSV－HCP－F和RSV－HCP－R為引物，通過 RT－PCR 擴(kuò)增 RSVHCP，1%瓊脂糖電泳分析結(jié)果表明：從RSV侵染的水稻樣品中擴(kuò)增到約260bp的預(yù)期片段，陰性對(duì)照則沒有擴(kuò)增到任何片段。將該片段克隆到pMD18－T載體，得到重組質(zhì)粒pMD18－T－HCP，對(duì)其測(cè)序結(jié)果表明目的片段長(zhǎng)度為256bp，與GenBank No.DQ299166.1序列的201～434bp序列完全一致，說明獲得了RSV CP基因的部分核苷酸片段RSVHCP。通過在NCBI上BLAST發(fā)現(xiàn)，與RSV－HCP核苷酸序列一致性達(dá)100%的分離物達(dá)42個(gè)，這也說明RSV－HCP序列是高度保守性，將有利于通過RNAi獲得抗RSV的轉(zhuǎn)基因植株。

2.1.2 中間載體的構(gòu)建

構(gòu)建RNAi載體需要一個(gè)兩側(cè)帶有多酶切位點(diǎn)的合適Intron序列，以便將RSV－HCP的正反義鏈插入在Intron的兩翼，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。本研究選擇了具有水稻Intron的載體pMCG161，將RSV－HCP的正義鏈插入在酶切位點(diǎn)Asc I和AvrⅡ間，將反義鏈插入在酶切位點(diǎn)Spe I和Sac I間。當(dāng)片段正向、反向均連入載體后，此時(shí)的載體含有兩個(gè)AscⅠ酶切位點(diǎn)，它們分別位于正義片段和負(fù)義片段的兩端，因此采用AscⅠ對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行單酶切時(shí)，陽性質(zhì)粒得到兩個(gè)片段，其中1650bp的小片段為有效的 發(fā) 夾 結(jié) 構(gòu)，包 括 正 向 片 段 （256bp）、intron（1138bp）和反向片段（256bp）；而作為陰性對(duì)照的空質(zhì)粒，只得到一條約12913bp的大片段條帶（圖1），說明RNAi載體構(gòu)建成功，命名為pMCG161＋／－R，該載體具有氯霉素抗性。

圖1 重組質(zhì)粒pMCG161＋／－R的酶切鑒定（Asc I）Fig.1 Restriction analysis of recombinant plasmid pMCG161＋／－R with AscⅠ

2.1.3 適合農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的安全RNAi載體構(gòu)建

為了獲得適合農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化水稻的去潮霉素抗性基因的RNAi載體，采用限制性內(nèi)切酶BamH I和HindⅢ將RNAi載體pMCG161＋／－R上有效的發(fā)夾結(jié)構(gòu)切下，并在T4連接酶的作用下，連入到去除潮霉素抗性基因的載體pCMBIA1301－h(huán)pt（－）上獲得了重組載體pCAMBIA1301＋／－R，該載體具有卡那霉素抗性。以 antisense IP5′／antisense IP3′為引物，單克隆為模板進(jìn)行菌落PCR鑒定，結(jié)果表明：部分待檢樣品和陽性對(duì)照（pMCG161＋／－R）擴(kuò)增出1121bp的特異條帶，與預(yù)期片段大小一致，而陰性對(duì)照（pCMBIA1301－h(huán)pt（－））未擴(kuò)增出任何條帶。pCAMBIA1301＋／－R的酶切鑒定結(jié)果與pMCG161＋／－R相似，同樣得到了1650bp的條帶，證明無標(biāo)記基因的RNA干涉載體構(gòu)建成功。進(jìn)一步測(cè)序結(jié)果也說明RSV－HCP發(fā)夾結(jié)構(gòu)已連入載體pCMBIA1301－h(huán)pt（－）中，成功獲得了適合農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，且在T－DNA區(qū)內(nèi)不含有抗生素標(biāo)記基因的安全RNAi載體，命名為pCAMBIA1301＋／－R（圖2）。

圖2 RNAi載體pCMBIA1301＋／－R的T－DNA區(qū)示意圖Fig.2 The construct of pCMBIA1301＋／－R T－DNA

2.2 不同水稻品種的共轉(zhuǎn)化率

采用重組農(nóng)桿菌E13R和E1301（按照1∶1濃度配比），選擇水稻模式品種‘愛知旭’和對(duì)RSV高感、但優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的水稻品種‘武育粳3號(hào)’和‘淮稻5號(hào)’等進(jìn)行了共轉(zhuǎn)化。在轉(zhuǎn)化過程中，3個(gè)品種的成熟胚最初產(chǎn)生愈傷組織的能力無明顯的差別，但在重組農(nóng)桿菌侵染后，經(jīng)潮霉素篩選，‘愛知旭’產(chǎn)生的抗性愈傷組織最多，出愈率最高（25.6%）；其次是‘武育粳3號(hào)’，出愈率為23.3%；而‘淮稻5號(hào)’產(chǎn)生的抗性愈傷數(shù)最少，僅為7.9%。在隨后成苗過程中，‘愛知旭’成苗需要時(shí)間最短，約45d左右，成苗數(shù)也最多，再生率為38.3%；而‘武育粳3號(hào)’的成苗時(shí)間稍晚，需要50d左右，同時(shí)成苗數(shù)也略少（35.7%）。3個(gè)品種中‘淮稻5號(hào)’的成苗時(shí)間最晚，80d后才出現(xiàn)少量再生苗，同時(shí)成苗數(shù)也最少，僅5.6%的再生率。對(duì)再生植株進(jìn)行PCR檢測(cè)后，對(duì)陽性植株數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算共轉(zhuǎn)化率，采用ANOVA／MANOVA統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，并進(jìn)行多重比較，3個(gè)品種的共轉(zhuǎn)化率有顯著差異?？梢钥闯鏊酒贩N‘愛知旭’的共轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)9.07%；推廣品種‘武育粳3號(hào)’的共轉(zhuǎn)化率略低于‘愛知旭’，達(dá)到6.59%；而‘淮稻5號(hào)’的所有再生植株均未檢測(cè)到外源目的基因（表1）。由此可見，本研究所用的遺傳轉(zhuǎn)化體系最適合模式品種‘愛知旭’的轉(zhuǎn)化，其次是‘武育粳3號(hào)’，而不適合‘淮稻5號(hào)’的轉(zhuǎn)化。

表1 不同水稻品種的轉(zhuǎn)化效率1）Table 1 Co－transformation efficiencies of different rice varieties

2.3 不同菌液配比對(duì)共轉(zhuǎn)化率的影響

選用最適合RNAi載體pCAMBIA1301＋／－R的共轉(zhuǎn)化受體品種‘愛知旭’，分別用菌液E13R與E1301按照3∶1、2∶1、1∶1、1∶2混合對(duì)350個(gè)愈傷進(jìn)行了共培養(yǎng)，對(duì)抗性愈傷、再生植株數(shù)等的統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)E1301菌液濃度較高時(shí)（E13R：E1301為1∶2），盡管抗性愈傷和再生苗數(shù)都相對(duì)較多，但hptⅡ和RSV－HCP的共轉(zhuǎn)化率較低（5.97%），而當(dāng) E13R菌液濃度較高時(shí)（2∶1和3∶1）hptⅡ和 RSV－HCP的共轉(zhuǎn)化率較高（13.56%～16.33%），最終獲得的轉(zhuǎn)基因再生陽性植株數(shù)目較多（表2）。

表2 不同農(nóng)桿菌菌液濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響Table 2 Effects of different density ratios on co－transformation efficiency

2.4 無潮霉素抗性基因植株的獲得

將獲得的33個(gè)轉(zhuǎn)基因再生植株，通過帶毒灰飛虱人工接種后，其中5株未表現(xiàn)癥狀（0級(jí)），9株表現(xiàn)輕微癥狀（Ⅰ級(jí)），5株表現(xiàn)中等癥狀（Ⅱ級(jí)），12株癥狀嚴(yán)重（Ⅲ級(jí)），而受體‘愛知旭’發(fā)病嚴(yán)重，全部為Ⅱ級(jí)或Ⅲ級(jí)，發(fā)病率為100%。PCR檢測(cè)結(jié)果表明：表現(xiàn)為0～Ⅰ級(jí)的轉(zhuǎn)基因再生植株均擴(kuò)增到潮霉素抗性基因（hptⅡ）和RSV－HCP。

圖3 T1代植株的PCR檢測(cè)Fig.3 Analysis of T1transformation of hptⅡ gene and RSV－HCP fragment

對(duì)33個(gè)株系的T1代植株進(jìn)行帶毒灰飛虱人工接種，篩選到14個(gè)株系的87株不表現(xiàn)病害癥狀的植株，通過雙重PCR檢測(cè)潮霉素抗性基因（hptⅡ）和RSV－HCP（圖3），其中16株（5個(gè)株系）為不攜帶hptⅡ的陽性植株。說明通過本研究構(gòu)建的載體成功獲得了不攜帶選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因抗病毒植株，為進(jìn)一步育種應(yīng)用打下了良好的基礎(chǔ)。

3 討論

在植物轉(zhuǎn)基因過程中，選擇標(biāo)記基因的使用使得大量篩選抗性愈傷和再生植株成為可能。傳統(tǒng)的做法是將標(biāo)記基因和目的基因串聯(lián)起來，置于同一載體（T－DNA）內(nèi)，以便通過標(biāo)記基因篩選低頻率的轉(zhuǎn)化事件［1，4，17］，但后期刪除標(biāo)記基因卻非常困難。隨著人們環(huán)保意識(shí)的加強(qiáng)，對(duì)標(biāo)記基因的安全性提出了質(zhì)疑，并引起了國(guó)際上的普遍關(guān)注，不同的國(guó)家也制定了相關(guān)的條款和法規(guī)加以限制。因此，在獲得轉(zhuǎn)基因植株后，是否能成功去除標(biāo)記基因?qū)D(zhuǎn)基因材料的育種應(yīng)用和安全釋放至關(guān)重要。在國(guó)內(nèi)外，已有通過RNAi技術(shù)使水稻獲得抗RSV特性的報(bào)道。Park［1］利用 RSV 的全長(zhǎng) CP，Zhou［17］利用 RSV 的全長(zhǎng)SP分別構(gòu)建了RNAi載體，遺傳轉(zhuǎn)化水稻，均獲得了高抗或免疫的植株。Shimizu［5］更是將RSV編碼的7個(gè)基因的部分核苷酸序列（500bp）都構(gòu)建成RNAi載體，分別導(dǎo)入水稻模式品種‘日本晴’，比較含不同基因的轉(zhuǎn)基因植株的抗病性差異，試驗(yàn)表明轉(zhuǎn)化RSV CP和RSV SP的植株具有良好的抗性。但上述試驗(yàn)更多的是在做機(jī)制層面上的研究，為了便于篩選，其轉(zhuǎn)基因植株均攜帶有選擇標(biāo)記基因，難以直接投入生產(chǎn)或進(jìn)行育種應(yīng)用。另外，已有研究表明僅60～200bp的病毒基因片段就能誘導(dǎo)RNA沉默從而獲得抗病毒抗性［18］，所以只要選擇具有高度保守性的RSV基因片段，就能達(dá)到全長(zhǎng)基因的效果，這樣不僅大大簡(jiǎn)化了構(gòu)建植物表達(dá)載體的工作量，還縮小了T－DNA區(qū)的長(zhǎng)度，更利于遺傳轉(zhuǎn)化和減小對(duì)水稻基因組的影響。

雙菌、雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化法作為一種簡(jiǎn)便易行的去除選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因方法，目前得到了廣泛的應(yīng)用，而利用雙菌、雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化RNAi載體還未見報(bào)道。由于目的基因和選擇標(biāo)記基因分別位于兩種質(zhì)粒上，再加上RNA干涉載體的T－DNA區(qū)片段大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，使其共轉(zhuǎn)化效率難以達(dá)到預(yù)期結(jié)果。本文利用RSV CP基因（969bp）的高度保守區(qū)段（RSV－HCP，234bp）構(gòu)建了RNA干涉載體，與全長(zhǎng)CP基因相比，既能保證對(duì)RSV CP基因的RNA干涉效果，還大大縮短了外源插入片段，使得轉(zhuǎn)化率（轉(zhuǎn)化率＝再生苗數(shù)／共培養(yǎng)的愈傷數(shù)×100%）最高可達(dá)到19.14%，相比單質(zhì)粒轉(zhuǎn)全長(zhǎng)CP基因的轉(zhuǎn)化率（15%）［4］有明顯提高。

在雙菌雙質(zhì)粒轉(zhuǎn)化中，通常的做法是將重組農(nóng)桿菌菌液濃度按照1∶1配比，本試驗(yàn)首先比較了在該配比下轉(zhuǎn)化水稻模式品種‘愛知旭’及生產(chǎn)上的推廣品種‘武育粳3號(hào)’和‘淮稻5號(hào)’的差異。結(jié)果表明，‘愛知旭’的共轉(zhuǎn)化率最高，‘武育粳3號(hào)’次之，而‘淮稻5號(hào)’沒有獲得任何陽性植株，不同品種間的差異較為顯著。這主要是由于在植物的遺傳轉(zhuǎn)化中，決定轉(zhuǎn)化成功與否的重要因素為材料的再生能力和效率，而這兩者最終是由品種的基因型決定的。此外，本研究結(jié)果表明在一定范圍內(nèi)，含有目的基因的重組農(nóng)桿菌濃度越高轉(zhuǎn)化效率越高，當(dāng)E13R與E1301配比為3∶1時(shí)，共轉(zhuǎn)化率最高，濃度配比為2∶1時(shí)次之，濃度比為1∶2時(shí)最低，可能的原因是pCMBIA1301＋／－R 的 T－DNA 區(qū)（11297bp）相對(duì)于pCMBIA1301的 T－DNA 區(qū)（5576bp）要 大 很多，這就造成了發(fā)卡結(jié)構(gòu)相對(duì)于潮霉素抗性基因更難插入水稻的基因組中。本文通過雙菌雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化水稻模式品種‘愛知旭’和生產(chǎn)上推廣品種‘武育粳3號(hào)’，均獲得了無標(biāo)記基因抗RSV的轉(zhuǎn)基因植株，為轉(zhuǎn)基因材料進(jìn)一步的推廣應(yīng)用鋪平了道路。

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