張吉紅， 余澍瓊， 徐 瑛， 張慧麗， 陳先鋒＊， 陳劍平， 陳 炯

（1.寧波出入境檢驗檢疫局，寧波 315012；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，杭州 310021；3.寧波大學(xué)，寧波 315211）

草莓潛隱環(huán)斑病毒（Strawberry latent ringspot virus，SLRSV）隸屬于伴生豇豆病毒科（Secoviridae）［1］，是薔薇科果實類作物上的重要病害之一，也是國家質(zhì)檢總局發(fā)布的重要檢疫性有害生物。該病害主要分布在歐洲、美國和俄羅斯等地區(qū)。SLRSV能侵染種子、種球、塊莖和苗木等，病毒侵染植株后，主要表現(xiàn)為葉片褪綠、畸形、植株矮化、產(chǎn)量以及品質(zhì)下降等現(xiàn)象，嚴(yán)重時可引起毀滅性災(zāi)害。SLRSV主要通過長劍線蟲（Xiphinemasp.）傳播，機械、嫁接和種子均可傳播。目前，SLRSV的檢測方法主要有指示植物小葉嫁接法、血清學(xué)檢測和分子生物學(xué)檢測等。指示植物小葉嫁接法，SLRSV的癥狀表現(xiàn)比較復(fù)雜，同種病毒在不同的指示植物上，癥狀變化比較大，而且該方法對于病毒種類的鑒定檢測耗時長；血清學(xué)檢測法具有快速簡便和高通量的優(yōu)點，目前已有10多種草莓病毒或類似病毒可用ELISA進(jìn)行檢測；另外，實時熒光RT－PCR技術(shù)檢測草莓病毒也有報道［2］，該方法具有較高的靈敏度和特異性，但是對設(shè)備和人員技術(shù)能力的要求較高。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（Loop－mediated isothermal amplification，LAMP）作為一種新的核酸擴增方法，具有檢測速度快、操作簡單和靈敏度高等優(yōu)點。首先，LAMP技術(shù)是呈瀑布式擴增，故其擴增效率非常高；其次，LAMP識別靶序列上的6～8個特異性位點，因此特異性很強；再次，LAMP技術(shù)是在60～65℃恒溫下擴增，只要恒溫水浴鍋即可，無需特殊儀器，所以操作方便，對設(shè)備要求低；最后，LAMP的整個反應(yīng)周期只需1～2.5h，檢測周期非常短?；贚AMP技術(shù)以上的優(yōu)點，本文針對草莓潛隱環(huán)斑病毒的RT－LAMP檢測方法的建立進(jìn)行了研究報道。

1 材料與方法

1.1 供試材料

含有SLRSV的陽性樣品物質(zhì)購自美國Agdia公司。經(jīng)DAS－ELISA檢測呈SLRSV陽性的百合樣品由上海檢驗檢疫局提供。番茄環(huán)斑病毒（Tomato ringspot virus，ToRSV）、香石竹環(huán)斑病毒（Carnation ringspot virus，CRSV）、黃瓜綠斑駁花葉病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）、南芥菜花葉病毒（Arabis mosaic virus，ArMV）以及馬鈴薯V病毒（Potato virus V，PVV）等陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)也都購自美國Agdia公司。

RT－LAMP引物由上海英駿生物技術(shù)公司合成。核酸提取試劑Trizol購自上海生物工程公司。RT－LAMP擴增試劑盒由本實驗室研制。One－step RNA PCR kit與DL－2000marker購自大連 TaKa－Ra公司。

引物序列見表1，根據(jù)GenBank（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov）中已登錄的草莓潛隱環(huán)斑病毒的外殼蛋白基因序列（AY860979），采用Blast程序進(jìn)行同源性比較，在序列的保守區(qū)，使用Primer Express 3.0軟件，設(shè)計得到F3、B3、FIP（F1c＋TTTT＋F2）、BIP（B1c＋TTTT＋B2）、Loop1和Loop2共6條引物，分別識別外殼蛋白編碼基因的8個位點。

表1 草莓潛隱病毒RT－LAMP檢測引物Table 1 The RT－LAMP primers for identification of SLRSV

1.2 草莓潛隱環(huán)斑病毒的RT－LAMP擴增

總RNA提?。翰捎肨rizol試劑方法提?。?］。

反應(yīng)體系：2×RT－LAMP Mix 10μL，引物F3和B3各為0.2μmol／L，Loop1和Loop2的終濃度各為0.8μmol／L，F(xiàn)IP和BIP的終濃度各為1.6μmol／L，Bst DNA聚合酶（5U／μL）1.5μL，AMV RNA 聚合酶（5U／μL）1μL，模板 RNA 1μL，用ddH2O補充至總體積20μL。

LAMP反應(yīng)液配制完成后，取SYBR green I（10000×）染色劑0.1μL加至反應(yīng)管的管蓋上，待反應(yīng)結(jié)束，離心反應(yīng)管使染色劑與反應(yīng)產(chǎn)物混合。當(dāng)擴增結(jié)果為陽性時，反應(yīng)液呈綠色，結(jié)果為陰性時呈橙紅色。在紫外燈下，陽性樣品管發(fā)出白色熒光，無擴增產(chǎn)物的樣品管沒有白色熒光。

反應(yīng)條件如下：在恒溫60℃的水浴鍋中擴增1h。

RT－LAMP結(jié)果分析：反應(yīng)結(jié)束后，取10μL擴增產(chǎn)物進(jìn)行2.0%瓊脂糖凝膠電泳，在GelDoc－2000（Bio－Rad）凝膠成像系統(tǒng)上觀察并記錄結(jié)果。

1.3 RT－LAMP的檢測反應(yīng)條件優(yōu)化試驗

以草莓潛隱環(huán)斑病毒RNA為模板，按照建立的RT－LAMP檢測方法，分別在60、63℃和65℃3個溫度條件下進(jìn)行擴增，反應(yīng)時間為1h。每個溫度條件設(shè)置2個RNA樣品重復(fù)，一個空白對照。

以草莓潛隱環(huán)斑病毒RNA為模板，按照建立的RT－LAMP檢測方法，分別在30、60min和90min 3個時間條件下進(jìn)行擴增，反應(yīng)溫度為60℃。每個時間條件設(shè)置2個RNA樣品重復(fù)，一個空白對照。

1.4 RT－LAMP的特異性和靈敏度試驗

抽提 得 到 SBMV、BPMV、SMV、TRSV 以 及ToRSV等病毒RNA，按照建立的ArMV RT－LAMP檢測方法，進(jìn)行特異性研究。健康大豆種子提取液作為陰性對照。

以 ToRSV、CRSV、CGMMV、ArMV 以及 PVV等多種植物病毒RNA為模板，按照建立的草莓潛隱環(huán)斑病毒RT－LAMP檢測方法，進(jìn)行特異性研究。其中，草莓潛隱環(huán)斑病毒設(shè)置2個RNA樣品重復(fù)，其余病毒設(shè)置1個RNA樣品，并設(shè)置1個空白對照。

將提取好的草莓潛隱環(huán)斑病毒RNA模板進(jìn)行10倍系列稀釋，得到10－1～10－5稀釋的病毒RNA樣品。采用建立的RT－LAMP和RT－PCR方法進(jìn)行擴增靈敏度比對試驗。

1.5 草莓潛隱環(huán)斑病毒RT－PCR檢測方法的建立

RT－PCR 反 應(yīng) 體 系 參 照 One－step RNA PCR kit試劑盒說明進(jìn)行，其中引物為F3和B3。反應(yīng)條件如下：50℃cDNA合成30min，94℃預(yù)變性2min；94℃變性30s，58℃復(fù)性30s，72 ℃延伸1min，35個循環(huán)；最后72℃延伸5min。

1.6 RT－LAMP擴增產(chǎn)物的觀察

將靈敏度試驗中的RT－LAMP擴增產(chǎn)物，用凝膠電泳法觀察擴增結(jié)果，剩下的產(chǎn)物中，直接加入0.1μL的熒光染料SYBR green I，混勻后肉眼觀察顏色變化，或置于凝膠成像系統(tǒng)中紫外觀察。

1.7 百合樣品中SLRSV的RT－LAMP快速檢測

取已用DAS－ELISA檢測呈SLRSV陽性的進(jìn)境百合樣品，采用本研究建立的RT－LAMP方法進(jìn)行擴增檢測，結(jié)果采用SYBR green I染色觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT－LAMP的檢測反應(yīng)溫度優(yōu)化試驗結(jié)果

在相同反應(yīng)時間，本試驗設(shè)計的草莓潛隱環(huán)斑病毒的引物在60、63℃和65℃均出現(xiàn)明顯的條帶（圖1），擴增產(chǎn)物亮度在3個不同溫度之間沒有明顯的差異，反應(yīng)溫度最終確定為60℃。

圖1 SLRSV RT－LAMP方法的溫度優(yōu)化Fig.1 Optimization of temperature in RT－LAMP for SLRSV

2.2 RT－LAMP的檢測反應(yīng)時間優(yōu)化試驗結(jié)果

在60℃時，本試驗設(shè)計的草莓潛隱環(huán)斑病毒的引物在60min和90min均出現(xiàn)明顯的條帶（圖2），但在30min條件下未出現(xiàn)擴增條帶，反應(yīng)時間確定為60min。

圖2 SLRSV RT－LAMP檢測的時間優(yōu)化Fig.2 Optimization of time in RT－LAMP for SLRSV

2.3 草莓潛隱環(huán)斑病毒的RT－LAMP特異性擴增結(jié)果

草莓潛隱環(huán)斑病毒的陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)經(jīng)過RTLAMP擴增后，能夠得到特異性的瀑布狀條帶，而其他病毒毒株的RNA模板則無擴增條帶出現(xiàn)，空白對照中無特異性基因條帶（圖3）。這表明本研究設(shè)計的6條引物針對SLRSV的檢測具有非常好的特異性。

圖3 RT－LAMP特異性擴增SLRSV結(jié)果Fig.3 Specificity results of LAMP for SLRSV

2.4 RT－LAMP檢測靈敏度試驗

不同稀釋梯度的草莓潛隱環(huán)斑病毒RNA經(jīng)過RT－LAMP擴增后，其檢測靈敏度為10－3病毒稀釋液，比普通RT－PCR的靈敏度高出100倍（圖4）。

圖4 RT－LAMP和RT－PCR檢測SLRSV靈敏度結(jié)果Fig.4 Sensitivity results of RT－LAMP and RT－PCR for SLRSV

2.5 擴增產(chǎn)物的結(jié)果觀察

本研究利用沉淀法和染色法對LAMP產(chǎn)物進(jìn)行了檢測。LAMP沉淀較少，肉眼較難分辨沉淀的有無；LAMP產(chǎn)物中加入SYBR green I染色劑，對照顏色呈橙紅色，而有擴增產(chǎn)物則呈綠色（圖5a）。在紫外燈下觀察，空白對照和無RT－LAMP產(chǎn)物的樣品管均沒有發(fā)出白色熒光，而有RT－LAMP擴增產(chǎn)物的樣品管則發(fā)出白色熒光，且白色熒光的亮度與RNA模板濃度的高低成正比（圖5b）。RTLAMP擴增產(chǎn)物，用凝膠電泳法觀察結(jié)果和用熒光染料SYBR green I觀察的結(jié)果一致。

圖5 熒光染料SYBR green I處理RT－LAMP產(chǎn)物的觀察結(jié)果Fig.5 Observation of RT－LAMP products treated by SYBR green I

2.6 百合樣品中SLRSV的RT－LAMP快速檢測結(jié)果

采用本研究建立的RT－LAMP方法對百合SLRSV陽性樣品進(jìn)行檢測，并用熒光染料SYBR Green I法觀察，結(jié)果顯示，陽性樣品均顯示明顯的綠色。

圖6 RT－LAMP檢測百合樣品中SLRSV的結(jié)果Fig.6 Detection of SLRSV in the lily by RT－LAMP

3 討論

目前，草莓潛隱環(huán)斑病毒的主要檢測方法為ELISA和RT－PCR技術(shù)。兩種方法較以前的生物學(xué)接種方法來說，在靈敏度、特異性和檢測周期等方面已有了很大的進(jìn)步，但是檢測周期仍然在3.5h以上，耗時長，在現(xiàn)場快速檢驗方面仍顯不足；另外，RT－PCR技術(shù)在產(chǎn)物擴增和結(jié)果判斷方面，均對設(shè)備要求較高，不便于口岸對病毒檢測的快速篩查。

張躍偉等應(yīng)用熒光顯色檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV），結(jié)果顯示，在敏感性檢測中，RTLAMP與RT－PCR都能檢測包含靶基因片段的重組質(zhì)粒，熒光顯色劑判斷的結(jié)果與濁度判斷結(jié)果一致［4］；何琳等建立了白斑綜合征病毒環(huán)介導(dǎo)等溫擴增快速檢測方法，同時與巢式PCR進(jìn)行了比較分析，結(jié)果為最適反應(yīng)在64℃，恒溫條件60min內(nèi)完成，靈敏度較巢式PCR高出100倍，在1h內(nèi)即可完成檢測［5］；劉佳等建立的LAMP技術(shù)檢測菊花中番茄不孕病毒的方法為65℃保溫1h，加入2μL稀釋10倍的SYBR Green I，結(jié)果表明該方法檢測番茄不孕病毒具有高效、快速和靈敏度高等特點［6］。孫穎杰等建立了牙鲆彈狀病毒環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）檢測方法，該方法的檢測限為30fg RNA，比常規(guī)RT－PCR靈敏度高出100倍，與其他病毒沒有交叉反應(yīng)，檢測時間短，在1h內(nèi)即可完成檢測［7］。

LAMP反應(yīng)后打開蓋加染色劑及使用凝膠電泳驗證會造成不必要的污染過程，使結(jié)果出現(xiàn)假陽性。因此本研究LAMP檢測方法進(jìn)行優(yōu)化時采用電泳觀察的方式，以選擇最佳的反應(yīng)體系，從而提高草莓潛隱環(huán)斑病毒檢測效率。但在實際檢測過程中，該方法采用在LAMP反應(yīng)管蓋上滴加SYBR green I染色劑，待反應(yīng)結(jié)束后在不開蓋的情況下直接使染色劑與擴增產(chǎn)物混合，以此減少反復(fù)開蓋而造成的污染問題。

本試驗的LAMP檢測方法在1.5h內(nèi)完成了檢測的全過程，耗時短；產(chǎn)物擴增只需要恒溫水浴鍋，對設(shè)備要求低；試驗發(fā)現(xiàn)，本研究建立的RTLAMP檢測方法比RT－PCR的靈敏度高出100倍；且特異性好；結(jié)果判斷時在LAMP反應(yīng)體系中加入0.1μL熒光染料SYBR green I，反應(yīng)結(jié)果通過肉眼觀察綠色是否生成而進(jìn)行判定，實現(xiàn)反應(yīng)及產(chǎn)物檢測一步完成，其判斷結(jié)果和瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果完全一致，快速準(zhǔn)確方便；另外，本研究取已用DAS－ELISA檢測呈SLRSV陽性的進(jìn)境百合樣品進(jìn)行試驗，準(zhǔn)確率達(dá)到100%。本研究建立的方法適合植物中草莓潛隱環(huán)斑病毒的現(xiàn)場篩查及實驗室快速檢測。

［1］ Sanfacon H，Iwanami T，Karasev A V，et al.Family Secoviridae.［M］∥King A M Q，Adams M J，Carstens E B，eds.Virus Taxonomy：Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Elsevier／Academic Press， Amsterdam， 2012：881－899.

［2］ 周厚成，何水濤.草莓病毒病研究進(jìn)展［J］.果樹學(xué)報，2003，20（5）：421－426.

［3］ 聞偉剛，崔俊霞，趙秀玲，等.半巢式RT－PCR檢測進(jìn)口大豆中菜豆莢斑駁病毒的研究［J］.植物病理學(xué)報，2006，36（4）：296－300.

［4］ 張躍偉，李旭妮，郭盼盼，等.熒光顯色在環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的應(yīng)用［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2010，18（3）：508－513.

［5］ 何琳，徐海圣，王美珍，等.白斑綜合征病毒環(huán)介導(dǎo)等溫擴增快速檢測方法的建立［J］.水產(chǎn)學(xué)報，2010，34（4）：598－603.

［6］ 劉佳，黃叢林，吳忠義，等.環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)檢測菊花中番茄不孕病毒［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43（6）：1288－1294.

［7］ 孫穎杰，岳志芹，劉葒，等.牙鲆彈狀病毒環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測方法的建立與應(yīng)用［J］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010，29（2）：203－207.