高亞梅， 王相晶， 向文勝＊

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

卵菌（Oomycetes）屬于色藻界（Chromista），包括腐生菌及植物、動物和許多微生物的病原菌。病原卵菌導(dǎo)致許多作物、花卉等發(fā)生災(zāi)難性病害，例如引起大豆疫霉根腐病的大豆疫霉（Phytophthora sojae Kaufmann et Gerdemann）；引起的馬鈴薯晚疫病的 致 病 疫 霉 ［P.infestans （Montagne）de Bary］［1－2］。在進(jìn)化地位上，卵菌與褐藻和硅藻有較近的親緣關(guān)系，形成一個獨(dú)特的二倍體微生物類群［3］，其分子遺傳學(xué)的研究相對落后。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，卵菌基因組學(xué)及功能基因組學(xué)的研究逐漸受到研究者的重視，迅速積累了大量基因組數(shù)據(jù)資源，這些資源又成為卵菌功能基因組學(xué)研究的基礎(chǔ)之一，同時也是基因組數(shù)據(jù)挖掘的重要來源，加快了卵菌分子生物學(xué)的各項(xiàng)研究。本文對農(nóng)作物病原卵菌基因組數(shù)據(jù)庫資源及其檢索方法做一概述。

1 卵菌結(jié)構(gòu)基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫資源及檢索方法

隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展，高通量測序使得測序成本不斷降低，越來越多的基因組計劃啟動，甚至可以用宏基因組學(xué)（metagenomics）技術(shù)測定一個生物群體的序列。因此，在各類數(shù)據(jù)庫中積累了海量的生物序列信息，供研究者檢索、下載和分析?；蚪M序列及結(jié)構(gòu)、基因功能和調(diào)控元件的相關(guān)注釋可為深入研究病原菌毒力、致病性、寄主特異性調(diào)控、病原菌生化與生理機(jī)制、生態(tài)位適應(yīng)性等提供大量有用信息。目前，共有7個卵菌物種［大豆疫霉P.sojae、分枝疫霉P.ramorumWerres，De Cock et Man、致病疫霉 P.infestans、辣椒疫霉P.capsici Leonian、終極腐霉 Pythium ultimum Trow、Hyaloperonospora parasitica （G?um.）G?ker，Riethm.，Voglmayr，Weiss ＆ Oberw.和古巴假霜霉 Pseudoperonospora cubensis （Berkeley et Curtis）Rostovzev］的全基因組序列正式對外公布（詳見表1）［4－9］；另外2個卵菌物種（Peronospora parasitica Tul.及Saprolegnia parasitica Coker）的基因組測序工作正在進(jìn)行中。通過對這些基因組序列和結(jié)構(gòu)的分析揭示了卵菌基因組在大小、致病相關(guān)基因、專性活體寄生等方面存在多樣性［10］，并為病原菌遺傳與致病機(jī)理、宿主－病原菌相互作用的特征（宿主的特異性，毒性策略等）以及宿主－病原菌相互作用的進(jìn)化等各方面研究提供了大量的信息?；蚪M分析揭示的卵菌基因組進(jìn)化特征包括重復(fù)序列在基因組內(nèi)的擴(kuò)增、缺失、基因融合和基因垂直轉(zhuǎn)移等［11－13］。這些無疑都加深了我們對于卵菌基因組結(jié)構(gòu)及進(jìn)化的認(rèn)識。

表1 已公布的測序卵菌基因組信息資源Table 1 Oomycete sequenced genome database resources

聯(lián)合基因組研究所JGI網(wǎng)站（DOE Joint Genome Institute）提供細(xì)菌、古細(xì)菌、真核生物和宏基因組等眾多物種的基因組序列信息和分析服務(wù)，在其主頁的搜索工具欄選擇相應(yīng)的物種即可進(jìn)入相應(yīng)物種的數(shù)據(jù)庫，其中卵菌物種包括P.sojae、P.ramorum和P.cinnamomi［14］?；蚪M序列信息可通過該數(shù)據(jù)庫SEARCH功能進(jìn)行關(guān)鍵詞檢索，利用BLAST進(jìn)行序列相似性搜索，利用DOWNLOAD下載，利用BROWSE以圖形化方式瀏覽（見圖1）。另外 GO、KEGG、KOG、CLUSTER、SYNTENY提供基因功能、代謝圖譜、共線性、簇等注釋信息的查詢檢索。

圖1 JGI網(wǎng)站P.cinnamomi var.cinnamomi基因組瀏覽界面Fig.1 The genome browse interface of P.cinnamomi var.cinnamomi in JGI

VMD數(shù)據(jù)庫（VBI Microbial Database）［15］是另一重要的卵菌基因組數(shù)據(jù)庫，包括Pythium ultimum（V1.0），Phytophthora infestans（V4.0），P.capsici（V11.0），P.sojae（V1.0，V4.0，V5.0），P.ramorum（V1.0），H.arabidopsidis（V3.0，V6.0，V8.3）基因組及注釋信息。每個數(shù)據(jù)庫均提供圖形化的瀏覽方式，顯示每個基因的位置、模式和相關(guān)基因組的BLAST信息等。VMD數(shù)據(jù)庫還提供檢索、下載、注釋和工具箱等服務(wù)。檢索可以通過不同方式進(jìn)行，包括 Gene ID、GO ID、Scaffold Number、protein domains／motifs／functions、primary annotation、affymetrixID 等。檢索結(jié)果頁面提供基因的序列、基因組位置、功能注釋及軟件預(yù)測結(jié)果等信息。BLAST工具提供多個可選數(shù)據(jù)庫，包括已測序卵菌基因組、表達(dá)數(shù)據(jù)庫、大豆和擬南芥數(shù)據(jù)庫等，進(jìn)行有針對性的序列相似性比對分析。P.infestans T30－4基因組序列可以在Phytophthora infestans Database數(shù)據(jù)庫下載，該數(shù)據(jù)庫同樣提供各類分析工具和可視化的瀏覽頁面。

Pythium Genome Database是專門存儲Pythium ultimum序列信息的數(shù)據(jù)庫，包括其代表性菌株P(guān)ythium ultimum DAOM BR144的基因組序列和不同營養(yǎng)條件下的菌絲體的EST序列。在Pythium Genome Database可以下載 Genome Assembly、Transcripts、Proteins和Gene Model GFF3的信息。通過Genome Browser可視化瀏覽基因組，可以使用序列名、基因名、遺傳位點(diǎn)或區(qū)域標(biāo)記進(jìn)行檢索。BLAST工具可以選擇卵菌基因組、表達(dá)數(shù)據(jù)等12個數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對。該數(shù)據(jù)庫還將儲存Pythium ultimum另一菌株高通量測序結(jié)果，開展對兩菌株及它們與其他已測序卵菌的基因組比較研究。

卵菌基因組測序多采用第二代測序技術(shù)，隨著測序成本的下降，將會有更多的卵菌基因組數(shù)據(jù)產(chǎn)生，包括致病菌和非致病菌，為功能基因組學(xué)和比較基因組學(xué)研究提供更多的數(shù)據(jù)。

2 卵菌功能基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫資源及檢索方法

目前，在各種數(shù)據(jù)庫中均存儲了大量的各種類型、代表不同信息的數(shù)據(jù)，如何對這些數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得蘊(yùn)含其中的生物學(xué)意義是當(dāng)前生物信息學(xué)的重要研究領(lǐng)域。利用生物信息學(xué)方法對卵菌基因組內(nèi)大量未知功能基因的分析比較是基因功能研究和數(shù)據(jù)注釋的重要手段。以下介紹的一些常用的卵菌EST數(shù)據(jù)庫、綜合性功能基因組資源平臺和專門數(shù)據(jù)庫是開展卵菌功能基因組學(xué)研究的重要資源。

2.1 卵菌EST數(shù)據(jù)庫資源

卵菌表達(dá)序列標(biāo)簽EST序列（Expressed Sequence Tags，ESTs）的大量公布為進(jìn)行全面的基因結(jié)構(gòu)和功能研究提供了重要的數(shù)據(jù)，必將促進(jìn)對卵菌致病分子機(jī)制的認(rèn)識，從而為防治卵菌病害設(shè)計合理有效的策略。目前數(shù)據(jù)庫中的EST序列集中在已正式公布的基因組序列的卵菌物種中，例如已有大豆疫霉（P.sojae）的 EST約33350條，而致病疫霉（P.infestans）有99320條（http：∥phytophthora.vbi.vt.edu／EST），還包括一些正在或已完成測序的卵菌物種P.capsici、Phytophthora brassicae De Cock et al、Albugo candida （Pers.）Roussel等［16］。這些 EST序列大部分為病原卵菌侵染寄主植物過程中的轉(zhuǎn)錄組，代表疫霉侵染與致病過程中表達(dá)的基因，還包括卵菌不同發(fā)育階段及不同環(huán)境條件下的EST。卵菌EST存放于多個數(shù)據(jù)庫中，如基因組的數(shù)據(jù)庫、NCBI、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫OTD等，提供多種途徑可以獲取和檢索。

OTD卵菌轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)庫（Oomycetes Transcriptomics Database，V4.0，http：∥vmd.vbi.vt.edu／transcripts／）是一個整合的轉(zhuǎn)錄組和EST數(shù)據(jù)資源的數(shù)據(jù)庫［17］，儲存卵菌侵染寄主和不同生長條件下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，包括EST序列、NGS（next generation sequencing）轉(zhuǎn)錄組序列、數(shù)字基因表達(dá)譜序列 （Digital Gene Expression Profile，DGE）等。OTD瀏覽器以可視化方式顯示轉(zhuǎn)錄本的組裝，轉(zhuǎn)錄本在基因組上的定位、表達(dá)譜及轉(zhuǎn)錄本在基因組特定位置覆蓋度等信息。該數(shù)據(jù)庫提供多種檢索方式，可利用EST序列和重疊群ID號、關(guān)鍵詞、表達(dá)量等進(jìn)行檢索。來自H.arabidopsidis的37492 ESTs通過聚類形成Unigenes，并利用BLAST、InterProScan、TMHMM、TargetP和SignalP進(jìn)行了注釋。EST序列可從該數(shù)據(jù)庫下載。OTD提供與VMD、PTD數(shù)據(jù)庫的鏈接界面。疫霉轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)庫（Phytophthora transcriptomics database，PTD http：∥phy.njau.edu.cn／ptd）提供大豆疫霉的數(shù)字基因表達(dá)譜信息［18］，可通過基因ID、關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，利用序列比對BLAST搜索同源基因，可查看不同發(fā)育階段的差異表達(dá)基因。基于轉(zhuǎn)錄信息的基因研究是功能基因組學(xué)研究的重要策略，例如EST數(shù)據(jù)不僅為基因的功能研究提供有價值的表達(dá)信息，而且基于EST的電子基因克隆技術(shù)也可用來發(fā)現(xiàn)新基因。近年來，二代測序技術(shù)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄組序列為基因功能研究提供了更為有利的工具，例如RNA－Seq產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本信息可以更為有效地發(fā)現(xiàn)未知轉(zhuǎn)錄本和稀有轉(zhuǎn)錄本，提供轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)和表達(dá)水平信息，用于精確地識別可變剪切位點(diǎn)以及cSNP（編碼序列單核苷酸多態(tài)性）［19］。

2.2 卵菌綜合性功能基因組資源

綜合性疫霉病原菌基因組學(xué)資源（Comprehensive Phytopathogen Genomics Resource，CPGR）包括4個數(shù)據(jù)庫：基因組倉庫、注釋數(shù)據(jù)庫、轉(zhuǎn)錄物組裝和rDNA數(shù)據(jù)庫［20］?；蚪M倉庫儲存包括植物病原菌基因組及EST測序計劃信息，每年至少更新2次。注釋數(shù)據(jù)庫包含基因組注釋信息，包括物種名、所屬類群、引起的疾病、NCBI序列登錄號、基因組大小、測序計劃狀態(tài)及機(jī)構(gòu)、特征、相關(guān)注釋以及文獻(xiàn)信息等。數(shù)據(jù)庫頁面包含依據(jù)分類單元和測序狀態(tài)的過濾器功能。轉(zhuǎn)錄物組裝數(shù)據(jù)來自NCBI數(shù)據(jù)庫的EST和mRNA，去除低重復(fù)和污染序列后，經(jīng)拼接注釋而成。CPGR的轉(zhuǎn)錄物組裝和來自GenBank的序列可在其FTP下載。rDNA數(shù)據(jù)庫包括植物病原菌的名稱和分類單元標(biāo)識符，另外該數(shù)據(jù)庫在病原菌和植物病害之間做了超鏈接。CPGR的搜索工具允許用戶使用序列和功能注釋搜索該數(shù)據(jù)庫。卵菌注釋可以通過位點(diǎn)標(biāo)識符、功能、Pfam功能域、Interpro功能域搜索。對于已測序的卵菌，用戶可在CPGR網(wǎng)站利用其提供的一系列界面實(shí)現(xiàn)對基因組信息（序列和注釋信息）的瀏覽、下載和檢索。目前只有P.infestans T30－4和Pythium ultimum DAOM BR144可利 用 CPGR 的 genome browser進(jìn)行可視化瀏覽，包括等位基因、基因模式（gene models）、rRNA 和tRNA 基因、推測的簡單重復(fù)序列SSRs（putative simple sequence repeats）、GC 含 量 （GC content）和 六 框 翻 譯 （sixframe translation）。位點(diǎn)信息和基因模式與其他內(nèi)容形成超鏈接?；蚪M瀏覽器還包括基因列表（gene list）、RNA 基因列表（RNA gene list）、Pfam功能域列表、Interpro功能域列表、推測SSRs，縮放工具允許用戶在各個分辨率水平瀏覽基因組。主頁的resource項(xiàng)下包含的簡單重復(fù)序列標(biāo)記搜索工具（SSR Candidate Marker Search Tool）可以用于對提交的序列進(jìn)行SSR搜索，并利用PRIMER3搜索合適的擴(kuò)增引物。用戶可自行設(shè)定SSR類型和重復(fù)數(shù)目。SSRs廣泛存在于各類生物基因組中，是應(yīng)用較為廣泛的遺傳標(biāo)記［21－22］。在基因組序列水平上對SSR的系統(tǒng)分析是SSR分子標(biāo)記的基礎(chǔ)性工作［23－24］。我 們 利 用 CPGR 數(shù) 據(jù) 庫 的 SSR 數(shù) 據(jù) 對P.infestans與Pythium ultimum 基因組內(nèi)的SSR進(jìn)行了比較分析。P.infestans包含1958個SSR，平均每122.5kb有一個SSR，Pythium ultimum 包含1911個SSR，平均每22.39kb有一個SSR，兩基因組內(nèi)均以二、三、六堿基重復(fù)為最豐富，在基序的重復(fù)次數(shù)上也具有一定的相似性。在二、三、六堿基重復(fù)中，每種都存在優(yōu)勢基序，詳見表2。在P.infestans基因組中，二、三、六堿基重復(fù)分別占總SSR的26.3%，21.81%和35.44%，在 Pythium ultimum中它們所占的百分比分別為27.68%，26.84%和27.42%，其他堿基重復(fù)所占的比例很少。在兩基因組二、三堿基重復(fù)的優(yōu)勢基序中，大部分是相同的優(yōu)勢基序類型，但是六堿基重復(fù)的優(yōu)勢基序相同的比較少，而且，六堿基重復(fù)的基序類型分布也比較分散。但是兩基因組的重復(fù)序列的長度都在20bp左右，長序列較少。而且有些基序類型沒有出現(xiàn)。由以上分析可以看出，兩個卵菌基因組內(nèi)的SSR數(shù)目相差不多，但由于基因組大小差異導(dǎo)致SSR在基因組內(nèi)的密度存在差異。優(yōu)勢堿基重復(fù)單元集中在二、三、六，說明其遺傳變異速度中等。SSR長度比較集中。基因組水平上的SSR分析為在以后的研究中應(yīng)用SSR標(biāo)記提供了有用的信息。由于SSR標(biāo)記在已測序卵菌基因組內(nèi)的位置及側(cè)翼序列是已知的，所以可以快速、準(zhǔn)確地找到連鎖的基因位點(diǎn)，從而完成候選基因的篩查、鑒定、基因注釋及功能研究，SSR標(biāo)記將在卵菌功能基因組研究中發(fā)揮重要作用。

CFGP（Comparative Fungal Genomics Platform）是一個綜合性的真菌比較基因組學(xué)平臺，包含283個真菌基因組的數(shù)據(jù)信息（6個卵菌）、專門數(shù)據(jù)庫的超鏈接和各類比較基因組分析工具，包括BLAST、ClustalW、InterProScan、SignalP等［25］。平臺采用數(shù)據(jù)驅(qū)動的用戶界面（Data－driven User Interface DUI），用戶可實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)瀏覽，選擇和分析的連續(xù)進(jìn)行，節(jié)省收集數(shù)據(jù)、轉(zhuǎn)化數(shù)據(jù)格式、提交數(shù)據(jù)、不同數(shù)據(jù)庫間瀏覽查詢的時間，極大地方便了大量數(shù)據(jù)的分析。該平臺的數(shù)據(jù)查詢主要是通過頁面的SEQUENCE菜單實(shí)現(xiàn)，有10種查詢方式：Taxonomy、Contig、Genome reference、MyGene、SWISSprot、MSIPI、NR、PDB、PDBchain、SequenceSet browser。數(shù)據(jù)通過 SNUGB（Seoul National University Genome Browser）以可視化方式顯示，并可以選擇顯示不同的數(shù)據(jù)庫信息。查詢到的序列通過勾選進(jìn)入到Favorites功能框架。Favorites作為生物信息分析的工作界面，包括Edit、Function、Anal－ysis和Download 4項(xiàng)功能，每個功能分若干項(xiàng)（見圖2）。其中的Function包括BLAST、BLASTmatrix等27種分析工具，是主要的分析界面，可用于序列比對分析、功能結(jié)構(gòu)域分析查詢、系統(tǒng)進(jìn)化分析、分泌蛋白分析、亞細(xì)胞定位、跨膜螺旋預(yù)測、RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測、翻譯后修飾和保守結(jié)構(gòu)域搜索。選擇一種工具后，CFGP即通過PERL模塊實(shí)現(xiàn)與相應(yīng)程序的鏈接，設(shè)定參數(shù)即可運(yùn)行獲得結(jié)果。分析結(jié)果保存在History中。除了查看自己的分析結(jié)果，在History中也可查看其他人在CFGP分析的結(jié)果。在分析工具中，值得一提的是BLASTMatrix工具，它用于在多個不同真菌物種中搜索潛在的同源基因。BLASTMatrix結(jié)果提供提交序列在每個物種最佳命中序列的列表，該列表以每個物種的分類地位組織在一起，同時會提供在不同分類群組內(nèi)同源基因的分布模式圖。輸出結(jié)果還包括InterPro或GO術(shù)語，可以幫助用戶預(yù)測可能的基因功能，進(jìn)一步分析確定其直系同源關(guān)系。

表2 P.infestans與Pythium ultimum基因組內(nèi)SSR二、三、六堿基重復(fù)優(yōu)勢基序Tabel 2 Major motifs of di－，tri－and hexa－nucleotide repeats in genome of P.infestans and Pythium ultimum

圖2 CFGP網(wǎng)站的Favorites工作界面Fig.2 The favorites interface in CFGP

FungiDB真菌功能基因組學(xué)資源，包括33種真菌和6種卵菌的基因組信息（V 2.1），整合了基因組序列和注釋信息，可開展比較基因組學(xué)研究、基因表達(dá)分析、生物信息學(xué)分析和數(shù)據(jù)挖掘等［26］。FungiDB提供利用多種策略在選定的單個或多個物種中進(jìn)行基因、ESTs、ORF、基因組序列等的快速檢索，可實(shí)現(xiàn)多步檢索策略的交叉、合并和刪除，創(chuàng)建用戶自己的檢索策略進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。同時提供包括BLAST、序列檢索（Sequence Retrieval）、文獻(xiàn)檢索（PubMed and Entrez）等分析工具。

2.3 卵菌專門數(shù)據(jù)庫資源

除了綜合性資源外，一些專門數(shù)據(jù)庫也是卵菌功能基因組學(xué)研究的重要資源。專門數(shù)據(jù)庫是針對特定目標(biāo)由一級數(shù)據(jù)庫衍生而來，對生物學(xué)知識和信息進(jìn)一步整理形成的二級數(shù)據(jù)庫，例如真菌分泌體數(shù)據(jù)庫FSD，專門存儲那些含有信號肽、在高爾基體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行加工能夠分泌到細(xì)胞外的蛋白，這些蛋白通過在全基因組水平進(jìn)行生物信息學(xué)分析確定，該數(shù)據(jù)庫中可以查詢到6種已測序卵菌的所有預(yù)測獲得的分泌體蛋白［27］。另外，真菌的轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫FTFD［28］、真菌細(xì)胞色素 P450數(shù)據(jù)庫 FCPD［29］等均存儲有卵菌的相應(yīng)蛋白的信息。這些專門數(shù)據(jù)庫可用于對于特定基因或領(lǐng)域的研究。

3 總結(jié)

基因組學(xué)極大地提高了我們對于植物病原菌的理解，例如卵菌病原菌的大量測序揭示了調(diào)控宿主與寄生物相互作用的效應(yīng)物分子類型［4，30－31］。通過在全基因組水平上對數(shù)據(jù)信息的挖掘，尤其是比較基因組學(xué)研究，將對揭示卵菌的特異性、病原菌群體結(jié)構(gòu)、卵菌與病害關(guān)系、發(fā)現(xiàn)病原菌診斷標(biāo)記起到重要作用［32］。隨著測序方法的發(fā)展，數(shù)據(jù)產(chǎn)生規(guī)模的提高，對數(shù)據(jù)的處理和挖掘已經(jīng)成為研究者的新挑戰(zhàn)。

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