張樹(shù)武， 徐秉良， 薛應(yīng)鈺， 古麗君

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室，中－美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，蘭州 730070）

根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)（Meloidogyne spp.）屬于植物根系定居性的寄生線(xiàn)蟲(chóng)，是當(dāng)前農(nóng)作物的病原線(xiàn)蟲(chóng)之一。近年來(lái)，隨著保護(hù)地蔬菜栽培的迅速發(fā)展，根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)對(duì)蔬菜的危害愈來(lái)愈嚴(yán)重，尤其是南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)[Meloidogyne incognita (Kofoid et White) ]由于其寄主范圍廣、致病性強(qiáng)、繁殖速度快和易傳播擴(kuò)散等特性，目前已成為世界各地蔬菜種植區(qū)最重要的病原物類(lèi)群之一［1］。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）估計(jì)，美國(guó)每年因線(xiàn)蟲(chóng)危害造成的經(jīng)濟(jì)損失為4%，而且主要是南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)引起的病害，且在采用防治措施并取得良好防治效果的情況下，每年仍有500萬(wàn)美元的損失［2］。在我國(guó)由于溫室連作現(xiàn)象甚為嚴(yán)重，致使許多老齡溫室南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病害的發(fā)生尤為嚴(yán)重，一般每年造成10%～15%的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重者損失可達(dá)30%～40%，甚至絕產(chǎn)［3］。同時(shí)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的侵入可造成一定的傷口，有利于土壤中其他病原物的侵入，進(jìn)而根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)與其他病原微生物聯(lián)合侵染形成復(fù)合性病害，進(jìn)一步加重了其危害程度，如加重了枯萎病、根腐病等土傳性病害的發(fā)生［4］。

目前對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病害采取的防治措施仍以化學(xué)防治為主，種植抗病品種為輔，但大多數(shù)化學(xué)殺線(xiàn)劑由于毒性高、品種少、污染環(huán)境和使用過(guò)程中對(duì)人、畜不安全等缺陷已被禁用［5］。同時(shí)抗性品種的應(yīng)用目前也受到了一定程度的限制，尤其是在一個(gè)地區(qū)連續(xù)種植單一抗病品種之后，品種的抗性會(huì)逐漸喪失［6］。因此，鑒于化學(xué)防治和種植抗病品種的局限性，以及無(wú)公害蔬菜生產(chǎn)的要求，對(duì)根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的微生物防治是目前國(guó)內(nèi)外線(xiàn)蟲(chóng)生物防治的重點(diǎn)和熱點(diǎn)之一。

木霉（Trichoderma）是一類(lèi)分布廣泛的土壤習(xí)居菌［7］。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，木霉對(duì)一些土傳病原菌具有很好的拮抗作用，如絲核菌屬（Rhizoctonia）、腐霉屬（Pythium）、小核菌屬（Sclerotium）、鐮刀菌屬（Fusarium）等［8］。近年來(lái)，對(duì)哈茨木霉（Trichoderma harzianumRifai）和綠色木霉（T.viride Pers.exFr.）在植物病原菌的拮抗方面有較多的研究和報(bào)道，但有關(guān)長(zhǎng)枝木霉（T.longibrachiatumRifai）的研究和報(bào)道較少，尤其是對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的致死和寄生作用目前還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)通過(guò)長(zhǎng)枝木霉分生孢子懸浮液對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)致死和寄生作用過(guò)程的顯微觀察，以及致死和寄生作用的測(cè)定及作用機(jī)理的初步研究，分析和討論長(zhǎng)枝木霉殺線(xiàn)蟲(chóng)作用的有效物質(zhì)，以便為新型、高效的微生物型殺線(xiàn)劑的研制、開(kāi)發(fā)和合理應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

長(zhǎng)枝木霉菌株由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。2011年6月從甘肅省慶陽(yáng)、榆中、武威等地蔬菜大棚的黃瓜病根和根際病土中分離得到。供試黃瓜品種為‘津研四號(hào)’，從甘肅省農(nóng)科院種子有限責(zé)任公司購(gòu)買(mǎi)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 長(zhǎng)枝木霉分生孢子懸浮液的制備

在PDA平板上培養(yǎng)6d的長(zhǎng)枝木霉中加入1滴吐溫－80（Tween－80）和5mL無(wú)菌水充分振蕩使長(zhǎng)枝木霉分生孢子脫落在無(wú)菌水中，即得到長(zhǎng)枝木霉分生孢子懸浮液的原液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)原液的濃度（1.5×107個(gè)／mL），同時(shí)依次稀釋成1.5×106、7.5×105、3.0×105和1.5×105個(gè)／mL備用。

1.2.2 根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的繁殖與接種

采用活體繁殖方法擴(kuò)繁。將采集的病根（切碎）和根際病土按體積比1∶3的比例混合，然后將其與無(wú)病土按體積比1∶5均勻混合，在直徑為10cm的塑料缽內(nèi)裝入500g混合土樣，每缽種植2株黃瓜，共種植18盆用于擴(kuò)繁。試驗(yàn)在溫度為（25±0.5）℃，每天16h光照條件下的溫室中進(jìn)行。

1.2.3 南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)的分離

從擴(kuò)繁的黃瓜根部根結(jié)上挑取南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的新鮮卵囊，并將經(jīng)NaClO消毒后的卵囊放入墊有2層擦鏡紙的線(xiàn)蟲(chóng)分離器中，在25℃下孵化13～20d，即得到大量的南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)備用。

1.2.4 2齡幼蟲(chóng)的計(jì)數(shù)

采用計(jì)數(shù)皿計(jì)數(shù)［9］。在體視顯微鏡下計(jì)數(shù)每個(gè)小格子的2齡幼蟲(chóng)數(shù)量，然后乘以總格數(shù)，這樣就可以得出每單位計(jì)數(shù)皿里2齡幼蟲(chóng)數(shù)量，然后通過(guò)加無(wú)菌水到量筒進(jìn)行定位，即可計(jì)算出每毫升無(wú)菌水中2齡幼蟲(chóng)的數(shù)量，最終使其數(shù)量為100條／mL備用。

1.2.5 長(zhǎng)枝木霉分生孢子懸浮液對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)致死和寄生作用過(guò)程的顯微觀察

在高溫滅菌的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入新孵化的南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)100條／孔，然后加入3mL濃度為1.5×107個(gè)／mL長(zhǎng)枝木霉分生孢子懸浮液，以加入3mL無(wú)菌水作為對(duì)照，試驗(yàn)共設(shè)置1個(gè)處理和1個(gè)對(duì)照，并且每個(gè)處理和對(duì)照3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)在（25±0.5）℃下進(jìn)行，并每隔2d在顯微鏡下觀察處理中2齡幼蟲(chóng)被寄生和死亡的過(guò)程。

1.2.6 長(zhǎng)枝木霉分生孢子懸浮液對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)致死和寄生作用的測(cè)定

在高溫滅菌的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入新孵化的南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)100條／孔，然后分別向各處理中加入不同濃度長(zhǎng)枝木霉分生孢子懸浮液（1.5×105～1.5×107個(gè)／mL）各3mL，以加入3mL無(wú)菌水作為對(duì)照，試驗(yàn)共設(shè)置5個(gè)處理和1個(gè)對(duì)照，每個(gè)處理和對(duì)照重復(fù)3次，分別在（25±0.5）℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并在24、48和72h記錄死亡的線(xiàn)蟲(chóng)數(shù)，計(jì)算其死亡率、校正死亡率、致死中量、回歸方程、相關(guān)系數(shù)（采用最小二乘法計(jì)算其致死中量）［10］。同時(shí)在6d后，每隔2d記錄被寄生的線(xiàn)蟲(chóng)數(shù)量，并計(jì)算其寄生率。

1.2.7 線(xiàn)蟲(chóng)的死活鑒別

采用“體態(tài)法”和“NaOH”刺激法［9］。在體視顯微鏡下，觀察經(jīng)過(guò)不同濃度長(zhǎng)枝木霉分生孢子懸浮液處理的2齡幼蟲(chóng)活動(dòng)狀態(tài)和體態(tài)。死亡的2齡幼蟲(chóng)蟲(chóng)體一般是僵直的，而存活的2齡幼蟲(chóng)蟲(chóng)體一般是彎曲的，且可以不斷地移動(dòng)。然后將蟲(chóng)體僵直的2齡幼蟲(chóng)再次分離后置于盛有2%鹽水的培養(yǎng)皿中，在體視顯微鏡下用竹針輕輕撥動(dòng)2齡幼蟲(chóng)，靜止不動(dòng)的即為死亡個(gè)體。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和表格繪制，并采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 長(zhǎng)枝木霉分生孢子懸浮液對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)致死和寄生作用過(guò)程的顯微觀察

試驗(yàn)結(jié)果表明，長(zhǎng)枝木霉分生孢子懸浮液對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)具有較強(qiáng)的寄生和致死作用。鏡檢觀察到，當(dāng)將新孵化的2齡幼蟲(chóng)浸入長(zhǎng)枝木霉分生孢子懸浮液時(shí)，初期2齡幼蟲(chóng)活動(dòng)正常。2d后大部分2齡幼蟲(chóng)僵硬不動(dòng)，只有少部分緩慢活動(dòng)，并且有的出現(xiàn)波紋狀扭曲，然后很快僵硬不動(dòng)，呈麻痹狀態(tài)。4d后鏡檢觀察，處理的2齡幼蟲(chóng)基本僵硬不動(dòng)，并且有些僵直不動(dòng)的2齡幼蟲(chóng)可以觀察到其口針（圖1－a），而對(duì)照活動(dòng)正常。6d后鏡檢觀察，有的死亡蟲(chóng)體顏色發(fā)生變化且有少量的分生孢子吸附或寄生于其體壁上（圖1－b）。8d后大量的分生孢子寄生并包圍在蟲(chóng)體的周?chē)▓D1－c）；10d后鏡檢觀察，大量的分生孢子寄生于蟲(chóng)體上，并萌發(fā)出大量的菌絲穿透蟲(chóng)體體壁（圖1－d和圖1－e）。12d后死亡的蟲(chóng)體出現(xiàn)畸形，尤其是分生孢子寄生的部位出現(xiàn)明顯的縊縮（圖1－f）；第14天鏡檢觀察，有的蟲(chóng)體開(kāi)始溶解，且蟲(chóng)體完全變形，模糊不清（圖1－g），而對(duì)照組蟲(chóng)體顏色和形態(tài)依然保持完整，無(wú)任何雜菌寄生（圖1－h(huán)）。

圖1 南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)被長(zhǎng)枝木霉分生孢子懸浮液處理后的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of the second stage juveniles of M.incognitainfected by the conidial suspension of T.longibrachiatum

2.2 長(zhǎng)枝木霉分生孢子懸浮液對(duì)2齡幼蟲(chóng)的致死作用

不同濃度長(zhǎng)枝木霉分生孢子懸浮液對(duì)2齡幼蟲(chóng)具有較強(qiáng)的致死作用與對(duì)照相比，并且隨著長(zhǎng)枝木霉分生孢子懸浮液濃度的增大而增大，隨著處理時(shí)間的增加而增加。尤其是在72h時(shí)濃度為1.5×107個(gè)／mL的長(zhǎng)枝木霉分生孢子懸浮液對(duì)2齡幼蟲(chóng)的死亡率和校正死亡率較高，分別為90.00%、88.81%，而對(duì)照死亡率僅為10.67%。同時(shí)由LC50值可知，24h時(shí)的LC50值大于48h，大于72h，即在72h時(shí)對(duì)2齡幼蟲(chóng)的致死作用最強(qiáng)，48h次之，24h最差（表1）。

表1 不同濃度長(zhǎng)枝木霉分生孢子懸浮液對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)的致死作用1）Table 1 Effects of different concentrations of T.longibrachiatumon the activities of the second－stage juveniles of M.incognita

2.3 長(zhǎng)枝木霉分生孢子懸浮液對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)的寄生作用

與對(duì)照相比，不同濃度長(zhǎng)枝木霉分生孢子懸浮液對(duì)2齡幼蟲(chóng)的寄生率均存在顯著的差異，并且其寄生率隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，隨著處理濃度的增大而增大，同時(shí)在處理后第14天濃度為1.5×107個(gè)／mL的長(zhǎng)枝木霉分生孢子懸浮液對(duì)2齡幼蟲(chóng)的寄生率高達(dá)87.33%，而對(duì)照始終沒(méi)有任何雜菌寄生（表2）。

表2 不同濃度長(zhǎng)枝木霉分生孢子懸浮液對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)的寄生作用1）Table 2 Effects of different concentrations of T.longibrachiatumon parasitism of the second－stage juveniles of M.incognita

2.4 長(zhǎng)枝木霉分生孢子懸浮液對(duì)2齡幼蟲(chóng)的致死作用與2齡幼蟲(chóng)的恢復(fù)

結(jié)果表明，2齡幼蟲(chóng)在不同濃度長(zhǎng)枝木霉分生孢子懸浮液中處理24和48h后基本麻痹，將其置于2%鹽水中部分可以恢復(fù)活性，并且隨著處理濃度越大和處理時(shí)間越長(zhǎng)，恢復(fù)率越低。在不同濃度長(zhǎng)枝木霉分生孢子懸浮液中處理72h后，基本上死亡，僅有個(gè)別的2齡幼蟲(chóng)恢復(fù)活動(dòng)，進(jìn)而證明不同濃度長(zhǎng)枝木霉分生孢子懸浮液具有較強(qiáng)的殺線(xiàn)蟲(chóng)活性（表3）。

表3 不同濃度長(zhǎng)枝木霉分生孢子懸浮液對(duì)2齡幼蟲(chóng)的致死作用與2齡幼蟲(chóng)的恢復(fù)Table 3 Effects of different concentrations of T.longibrachiatumon the activities and recovery rates of the second－stage juveniles

3 討論

根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)是農(nóng)作物的重要病原物之一，隨著全球氣候變暖和作物復(fù)種指數(shù)的不斷提高，根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)對(duì)作物的危害愈來(lái)愈嚴(yán)重［11］。因此，根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的生物防治受到了國(guó)內(nèi)外的廣泛重視，尤其利用自然界線(xiàn)蟲(chóng)的天敵微生物防治該病害已經(jīng)成為當(dāng)今線(xiàn)蟲(chóng)學(xué)界研究的新動(dòng)向和新趨勢(shì)［12］。

試驗(yàn)結(jié)果表明，長(zhǎng)枝木霉分生孢子懸浮液可作為一種新型、高效的微生物型殺線(xiàn)劑，對(duì)防治根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病害的發(fā)生具有廣泛的應(yīng)用潛力。不同濃度長(zhǎng)枝木霉分生孢子懸浮液對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)的致死和寄生作用隨著處理時(shí)間的增加而增加，隨著處理濃度的增大而增大。通過(guò)不同濃度長(zhǎng)枝木霉分生孢子懸浮液對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)致死和寄生作用效果的比較，尤其是濃度為1.5×107個(gè)／mL的長(zhǎng)枝木霉分生孢子懸浮液表現(xiàn)出較強(qiáng)的致死和寄生作用，可作為最佳的使用濃度應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中。目前，關(guān)于植物線(xiàn)蟲(chóng)病害的生物防治國(guó)內(nèi)外已有一些相關(guān)的報(bào)道。國(guó)內(nèi)外研究和應(yīng)用最多的線(xiàn)蟲(chóng)生防菌主要有淡紫擬青霉 ［Paecilomyces lilacinus（Thom）Samson］和厚垣輪枝孢菌（Verticillium chlamydosporiumGoddard），其對(duì)控制胞囊線(xiàn)蟲(chóng)和根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)等主要植物線(xiàn)蟲(chóng)起著十分重要的作用［13］，但已有許多臨床醫(yī)學(xué)報(bào)告表明淡紫擬青霉是一種機(jī)會(huì)性真菌，在人畜免疫力下降或免疫缺失情況下，能侵染人體或動(dòng)物皮膚和組織器官［14］。同時(shí)，淡紫擬青霉通常只寄生植物線(xiàn)蟲(chóng)的卵，侵染率與卵和真菌接觸的時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)［15］。厚垣輪枝孢一般侵染線(xiàn)蟲(chóng)的卵和雌蟲(chóng)，并且在不同植物根圍的定殖能力差別較大［16］。這可能與生防菌的種類(lèi)、生防菌的作用機(jī)制以及生防菌的寄主范圍等有關(guān)［17－18］。國(guó)內(nèi)劉霆等［19］報(bào)道的結(jié)果與本試驗(yàn)研究結(jié)果基本一致，綠色木霉發(fā)酵液原液處理后北方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)的校正死亡率為96.39%。付鵬等［20］報(bào)道生防菌劑GJ235倍、10倍稀釋液對(duì)根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)的活性具有強(qiáng)烈的抑制作用。同時(shí)本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，在較高濃度下線(xiàn)蟲(chóng)死亡率隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增加較顯著，而在較低濃度條件下，延長(zhǎng)作用時(shí)間殺線(xiàn)作用增加不明顯，可能是線(xiàn)蟲(chóng)對(duì)長(zhǎng)枝木霉代謝物產(chǎn)生了一定的耐受力，同時(shí)也可能是高濃度的長(zhǎng)枝木霉分生孢子懸浮液具有一定的后效作用［21］。

另外，本試驗(yàn)還首次對(duì)其作用機(jī)理進(jìn)行了初步的研究，通過(guò)顯微鏡觀察其侵染的過(guò)程表明：長(zhǎng)枝木霉在2齡幼蟲(chóng)的誘導(dǎo)下，侵染初期分生孢子吸附或寄生于2齡幼蟲(chóng)的體表，分生孢子萌發(fā)產(chǎn)生大量的菌絲穿透蟲(chóng)體體壁，并且在蟲(chóng)體內(nèi)繁殖菌體。侵染后期長(zhǎng)枝木霉通過(guò)產(chǎn)生某種微生物酶（幾丁質(zhì)酶）或殺線(xiàn)活性的代謝產(chǎn)物使蟲(chóng)體溶解［22］。關(guān)于木霉對(duì)致病性真菌的生防機(jī)制已有大量的報(bào)道，包括拮抗、競(jìng)爭(zhēng)、溶菌、寄生和誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生系統(tǒng)性抗性等［23］，但本試驗(yàn)也證實(shí)了其對(duì)致病性線(xiàn)蟲(chóng)也具有溶解和寄生作用。相似的報(bào)道也表明一些食線(xiàn)蟲(chóng)真菌和細(xì)菌體外可以產(chǎn)生具有殺線(xiàn)活性的代謝產(chǎn)物，如淡紫擬青霉發(fā)酵液中含有一定濃度的乙酸，能夠在很大程度上抑制線(xiàn)蟲(chóng)卵和幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育［24］。而厚垣輪枝孢菌本身也可以產(chǎn)生毒素，當(dāng)線(xiàn)蟲(chóng)卵與其接觸時(shí)，便停止孵化和發(fā)育［25］。

因此，長(zhǎng)枝木霉分生孢子懸浮液在防治植物線(xiàn)蟲(chóng)上具有廣闊的應(yīng)用前景，但目前對(duì)于長(zhǎng)枝木霉的研究還只是處于初級(jí)階段，還有很多問(wèn)題諸如其對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)的卵囊或胞囊、卵的寄生和致死作用及機(jī)理、對(duì)人畜及植物的安全性、持久性和針對(duì)性等有待進(jìn)一步深入的研究。

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