鄭國華， 蘇勇波， 鄭志忠， 彭德偉， 明艷林＊

（1.廈門華僑亞熱帶植物引種園，國家農(nóng)作物國外引種隔離檢疫基地，廈門市引種檢疫與植物源產(chǎn)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廈門 361002；2.廈門兆翔花卉科技有限公司，廈門 361010）

建蘭花葉病毒（Cymbidium mosaic virus，CyMV）屬于馬鈴薯X病毒屬（Potexvirus）成員，是危害蘭科植物最為嚴(yán)重的病毒之一［1］。調(diào)查表明國內(nèi)蘭花普遍受到該病毒的危害，特別是蝴蝶蘭、文心蘭、大花蕙蘭、墨蘭等蘭花種類［2－3］。該病毒基因由約6200nt的單鏈正義RNA組成，5′端帶有一個甲基化的核苷酸帽子結(jié)構(gòu)，3′端帶有一個poly（A），共編碼RNA聚合酶、TGBp1、TGBp2、TGBp3和CP等5個蛋白［4］。Potexvirus屬病毒的CP在病毒復(fù)制、組裝和移動等過程中都發(fā)揮著重要的作用［5］，因此CP基因被廣泛用于開展介導(dǎo)抗病毒研究［6］。國內(nèi)外學(xué)者先后將CyMV的CP基因轉(zhuǎn)入石斛蘭（Dendrobium）原球莖［7］、本塞姆氏煙（Nicotiana benthamiana）［8］、西方煙（Nicotiana occidentalis）［9］等寄主，發(fā)現(xiàn)病毒的復(fù)制和積累受到明顯抑制，展示了CP基因介導(dǎo)抗性的優(yōu)勢。但是在馬鈴薯Y病毒和番木瓜環(huán)斑病毒等CP基因介導(dǎo)應(yīng)用研究中發(fā)現(xiàn)，CP基因介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因植株對不同分離物的抗性存在著明顯的差異［10－11］，從而限制了該抗性技術(shù)的應(yīng)用。CyMV 分離物間CP基因（相似性85%～100%）存在明顯遺傳變異性［12］，因此有必要分析病毒CP基因遺傳變異和進(jìn)化趨勢，尋找穩(wěn)定遺傳的保守序列開展抗性基因的研究。

正單鏈RNA病毒3′UTR的序列及其二、三級結(jié)構(gòu)在病毒RNA復(fù)制酶啟動合成負(fù)鏈RNA時具有非常重要的作用，許多研究發(fā)現(xiàn)3′UTR可以通過形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)、類tRNA結(jié)構(gòu)和Poly（A）等方式參與病毒復(fù)制調(diào)控［13］。目前，Potexvirus屬的竹花葉病毒（Bamboo mosaic virus，BaMV）3′UTR結(jié)構(gòu)與功能研究較為深入，BaMV的3′UTR能夠形成類似三葉草莖環(huán)結(jié)構(gòu)A、B、C和D，形成類似tRNA的假結(jié)結(jié)構(gòu)［14］。RDRP能特異結(jié)合3′UTR，啟動負(fù)鏈RNA的合成，敲除3′UTR不同部位都能影響RNA復(fù)制［15］。CyMV與BaMV同屬于Potexvirus，具有非常相似的基因組成，因此研究CyMV 3′UTR的結(jié)構(gòu)和功能將有可能進(jìn)一步揭示病毒復(fù)制調(diào)控機(jī)制。

本文采用單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（single－strand conformation polymorphism，SSCP）快速檢測侵染不同蝴蝶蘭品種CyMV存在的遺傳變異，從中篩選得到5個存在變異的分離物并測定其CP和3′UTR基因序列。進(jìn)一步與其他分離物的CP基因進(jìn)行比較分析，研究CP基因存在的遺傳多樣性和作用于CP基因的選擇壓力，為開展抗病毒研究奠定基礎(chǔ)。并通過軟件預(yù)測3′UTR二級結(jié)構(gòu)，以期為深入研究該復(fù)制調(diào)控區(qū)域的結(jié)構(gòu)和功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 病毒毒源

蝴蝶蘭病株采自廈門蝴蝶蘭種植圃（品種編號：pl335、kq5503、kq6113、kf540、kf1023、jt1017、ypm166、j02037），均為組培分生苗，葉片出現(xiàn)褪綠、花葉和環(huán)斑等癥狀。經(jīng)斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫檢測篩選后，將病葉研磨后摩擦接種到曼陀羅上進(jìn)行單斑分離和保存。采用接種建蘭花葉病毒的曼陀羅病葉作為陽性對照，并以未接種病毒的曼陀羅葉片作為陰性對照。

1.1.2 試劑

CyMV斑點(diǎn)酶聯(lián)檢測試劑由本實(shí)驗(yàn)室制備。cDNA合成試劑盒、Taq聚合酶購自Promega公司。內(nèi)切酶Pst I、T－A克隆試劑盒、感受態(tài)細(xì)胞JM109、Trizol試劑盒、DNA膠回收試劑盒等均購自上海生物工程有限公司。分析已知分離物間的保守序列，根據(jù)保守序列設(shè)計3條引物，委托上海桑尼生物工程有限公司合成。引物5Fa（對應(yīng)AM055640的4900～4923nt）：5′－GTGTTAGCTTTTACTGCAGTGATC－3′、引物4R（與 AM055640的5278～5298nt 互 補(bǔ) ）：5′－ATTGCCAGGATGGTAGGAAA－3′；引 物 M4T（與 poly（A）互 補(bǔ) ）：5′－GTTTTCCCAGTCACGACTTTTTTTTTTTT－3′，其中5Fa／4R引物對預(yù)期擴(kuò)增條帶大小為399bp，5Fa／M4T引物對預(yù)期擴(kuò)增條帶約為1350bp。

1.2 方法

1.2.1 RT－PCR

采用Trizol試劑盒分別提取8個樣品、陽性對照和陰性對照葉片總RNA，采用cDNA合成試劑盒合成cDNA。用5Fa／M4T引物對擴(kuò)增部分TGB－ps、全長CP和3′UTR基因序列，PCR擴(kuò)增體系如下：50μL 總體積包括 10 × PCR buffer 5μL、dNTP mix（10mmol／L）1μL、引物5Fa（10μmol／L）和 M4T（10μmol／L）各2μL、cDNA 1μL、Taq酶（5U／μL）0.4μL；補(bǔ)充ddH2O至50μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性10min，先進(jìn)行94℃45s、50℃30s、72℃120s5個循環(huán)后將退火溫度提高58℃再進(jìn)行24次循環(huán)，最后72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察。

1.2.2 SSCP

取PCR產(chǎn)物稀釋1×105后作為模板，用5Fa／4R引物對擴(kuò)增TGB部分序列，PCR擴(kuò)增體系同1.2.1。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min，94℃30s、58℃20s、72℃30s，共24個循環(huán)，72℃延伸5min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收純化后，取純化產(chǎn)物2μL加入4μL上樣緩沖液（95%甲酰胺、0.5%溴酚藍(lán)），混勻后于95℃變性10min，取出立即冰浴5min后上樣。將電泳槽置于4℃冰箱內(nèi)，先使用10V／cm電壓電泳5min后，改用4V／cm電壓電泳12h。EB染色30min后在紫外燈下觀察。

1.2.3 序列測定與分析

將5Fa和M4T擴(kuò)增得到的8份PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收純化后，分別與pUCm－T載體進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化DH5α，篩選得到pUmcy07（pl335）、pUmcy11 （kq5503）、pUmcy18 （kq6113）、pUmcy42（kf540）、pUmcy46（kf1023）、pUmcy54（jt1017）、pUmcy58（ypm166）和pUmcy59（j02037）等陽性克隆，委托上海生物工程有限公司進(jìn)行序列測定。通過 Clustal Omega－Multiple Sequence Alignment（http：∥www.ebi.ac.uk／Tools／msa／）軟件進(jìn)行序列分析，通過基于Nei ＆Gojobori方法的SNAP在線分析軟件（http：∥www.hiv.lanl.gov／content／sequence／SNAP／SNAP.html）分析CP基因各位點(diǎn)非同義置換率（dN）和同義置換率（dS）值。采用RNAshapes軟件分析3′UTR形成的二級結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 RT－PCR擴(kuò)增結(jié)果

經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)，采用5Fa和M4T這對引物從來自8個蝴蝶蘭品種的CyMV分離物中均能擴(kuò)增得到1300bp左右的目的條帶。由于M4T引物與Poly（A）結(jié)合位點(diǎn)略有不同，擴(kuò)增片段大小應(yīng)該存在一定差異，但這種差異在電泳圖中沒有得到體現(xiàn)（圖1）。PCR產(chǎn)物經(jīng)稀釋后作為模板采用5Fa和4R這對引物進(jìn)行擴(kuò)增均能得到400bp左右的目的條帶（圖2）。

圖1 引物對（5Fa和M4T）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析Fig.1 Electrophoresis of PCR products using the primers 5Fa／M4T

圖2 引物對（5Fa和4R）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析Fig.2 Electrophoresis of PCR products using the primer 5Fa／4R

2.2 變異分離物篩選

采用SSCP對5Fa和4R擴(kuò)增得到的8個產(chǎn)物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過優(yōu)化SSCP條件均得到穩(wěn)定的帶型（圖3）。8個分離物擴(kuò)增片段均出現(xiàn)2個條帶，總共有5個帶型，其中kf1023、jt1017和ypm166帶型一 致，kf540、j02037 帶 型 一 致，pl335、kq5503、kq6113分離物帶型差異明顯。通過條帶存在的多態(tài)性，推測這8個分離物由5種存在明顯差異的分離物組成。進(jìn)一步提取8個分離物重組質(zhì)粒委托測序，結(jié)果表明5Fa和4R擴(kuò)增片段大小均為399bp。通過序列分析比對發(fā)現(xiàn)，pUmcy46（kf1023）、pUmcy54（jt1017）和 pUmcy58（ypm166）序列一致，pUmcy42（kf540）、pUmcy59（j02037）序列一致，其他3個分離物各不相同（圖4），與SSCP分析結(jié)果一致。

圖3 PCR產(chǎn)物單鏈構(gòu)象多態(tài)性電泳分析Fig.3 Electrophoresis of SSCP products of 8isolates

圖4 8個分離物擴(kuò)增片段堿基變異分析Fig.4 Molecular differentiation of 8isolates

2.3 CP基因進(jìn)化樹分析

根據(jù)SSCP分析和序列測定分析結(jié)果，本文對pl335、kq5503、kq6113、kf1023、j02037等分離物 CP基因進(jìn)行分析，通過分析發(fā)現(xiàn)它們的相似性為95.5%～99.9%。從已知GenBank登錄的130個分離物CP基因序列中選擇具有代表性的56個登錄序列和本研究的5個序列建立系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖5），分析表明這5個分離物都屬于亞組A。其中pl335（圖5：Phalaenopsis－pUmcy07）、kq6113（Phalaenopsis－pUmcy18）和 kf1023（Phalaenopsis－pUmcy46）3個分離物間相似性為99.4%～99.9%，與來自廈門（GQ507023）、廣東（FJ356061）蝴蝶蘭分離物親緣性較近（相似性為98.1%～98.8%）。kq5503（Phalaenopsis－pUmcy11）和 j02037（Phalaenopsis－pUmcy54）2個分離物間相似性為97.6%。與來自浙江（DQ067884、DQ067885）、福建（DQ067879）、廣東（AY360410）建蘭分離物親緣性較近（95.2%～97.6%）。分析分離物間的地理分布和寄主發(fā)現(xiàn)，各分離物間不存在明顯的地域和寄主相關(guān)性。

2.4 CP基因dN和dS的分析

對CP基因各堿基非同義替代率（dN）和同義替代率（dS）進(jìn)行計算，dN 平均為0.0418，dS平均為0.1205，平均dN／dS為0.3379，說明CP基因全長仍然為負(fù)向選擇。通過SNAP分析的dN和dS分布（圖6），可以看到CP的N端dN＞dS，表明受到正選擇壓力的作用，氨基酸發(fā)生變異的頻率較高；而CP的C端dN＜dS，表明受到負(fù)選擇壓力的作用，在病毒進(jìn)化過程中會凈化這些變異。

圖5 CP基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.5 Phylogenetic tree based on CP nucleotide sequences between different isolates of CyMV

2.5 3′UTR二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

分析3′UTR序列發(fā)現(xiàn)含有Potexvirus屬病毒RNA合成必需的順式元件“AC（C／T）TAA”和Poly（A）信號“AATAAA”。采用RNAshapes軟件預(yù)測3′UTR形成的二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域能夠形成類似三葉草莖環(huán)結(jié)構(gòu)（圖7A），順式元件位于莖環(huán)結(jié)構(gòu)A中，推測該區(qū)域在啟動負(fù)鏈RNA合成的過程中具有重要作用。

圖6 CP基因核苷酸的非同義替代率（dN）和同義替代率（dS）Fig.6 Cumulative plot of average nonsynonymous nucleotide substitution（dN）and average synonymous nucleotide substitution（dS）represented codon by codon

進(jìn)一步分析各分離物的3′UTR存在的遺傳變異（圖7B），發(fā)現(xiàn)10位（A／T）、28位（C／T）、31位（A／T／G）、47位（G／A）、59位（A／T／C）、60位（A／T／G）、61位（C／T）等變異位點(diǎn)均位于未配對區(qū)域，它們間的變異沒有改變莖環(huán)結(jié)構(gòu)；位于配對區(qū)域的49位（C／T）和68位（A／G）則是分別形成 A－T和G－C配對的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。56位堿基A出現(xiàn)缺失和突變?yōu)镚的情況降低了莖環(huán)穩(wěn)定性。由此可見，各分離物進(jìn)化過程中始終保持這種二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，推測這種結(jié)構(gòu)對病毒具有重要意義。

3 討論

Zhou等［16］根據(jù)CP基因序列相似性進(jìn)行進(jìn)化樹分析，認(rèn)為CyMV分離物間親緣關(guān)系與地理位置大體相關(guān)，亞洲各分離物和夏威夷分離物以很高相似系數(shù)聚集在一起，歐洲各分離物集成一大類，新加坡的一個分離物和泰國分離物是特例。Moles等［17］則明確這兩類分離物劃分為亞組A和亞組B。本文通過將這5個分離物與其他分離物進(jìn)行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們都屬于亞組A，未發(fā)現(xiàn)亞組B成員。進(jìn)一步分析各分離物CP基因的非同義替代／同義替代率，發(fā)現(xiàn)該CP基因5′端存在較高的非同義替代，推測該區(qū)域的變異是病毒應(yīng)對不同寄主和環(huán)境選擇壓力的策略。CP基因3′端普遍發(fā)生同義替代，編碼的氨基酸序列較為保守，因此可以作為抗性研究的重點(diǎn)。

圖7 CyMV 3′非編碼區(qū)莖環(huán)結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.7 Stem－loop structure prediction of CyMV 3′UTR

CyMV 3′UTR形成的類似三葉草的莖環(huán)結(jié)構(gòu)在同屬的BaMV已經(jīng)得到驗(yàn)證，而且CyMV不同分離物間的變異始終都維持著這種結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，由此可以推測這種結(jié)構(gòu)對于病毒具有非常重要的作用。但是目前僅僅通過分子結(jié)構(gòu)的熱力學(xué)穩(wěn)定性進(jìn)行模擬，其結(jié)構(gòu)和功能還有待進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

［1］ 明艷林，李梅，鄭國華.建蘭花葉病毒研究進(jìn)展［J］.福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，2005，20（1）：30－33.

［2］ 王鈺麗，李凡，李正躍，等.侵染蘭花引起壞死斑癥狀的病毒種類鑒定［J］.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2007，22（2）：222－224.

［3］ 明艷林，鄭國華，李梅.建蘭花葉病毒廈門分離物的鑒定及其抗血清的制備與應(yīng)用［J］.植物病理學(xué)報，2005，35（4）：366－369.

［4］ Wong S M，Mahtani P H，Lee K C，et al.Cymbidium mosaic potexvirus RNA：complete nucleotide sequence and phylogenetic analysis［J］.Archives Virology，1997，142（2）：383－391.

［5］ Chapman S，Hills G，Watts J，et al.Mutational analysis of the coat protein gene of Potato virus X：effects on virion morphology and viral pathogenicity［J］.Virology，1992，191（1）：223－230.

［6］ 明艷林，鄭金龍，鄭國華，等.蘭花抗病毒基因工程研究進(jìn)展［J］.亞熱帶植物科學(xué)，2010，39（1）：92－96.

［7］ Chang C，Chen Y C，Hsu Y H，et al.Transgenic resistance to Cymbidium mosaic virus in Dendrobiumexpressing the viral capsid protein gene［J］.Transgenic Research，2005，14（1）：41－46.

［8］ Chia T F，Chan Y S，Chua N H.Characterization of Cymbidium mosaic virus coat protein gene and its expression in transgenic tobacco plants［J］.Plant Molecular Biology，1992，18（6）：1091－1099.

［9］ Lim S H，Ko M K，Lee S J，et al.Cymbidium mosaic virus coat protein gene in antisense confers resistance to transgenic Nicotiana occidentalis［J］.Molecules and Cells，1999，9（6）：603－608.

［10］Tennant P F，Gonsalves C，Ling K S，et al.Differential protection against Papaya ringspot virus isolates in coat protein gene transgenic papaya and classically cross－protected papaya［J］.Phytopathology，1994，84：1359－1366.

［11］Vlugt V D，RenéA A，Goldbach R W.Tobacco plants transformed with the potato virus YNcoat protein gene are protected against different PVY isolates and against aphid－mediated infection［J］.Transgenic Research，1993，2（2）：109－114.

［12］Sherpa A R，Hallan V，Pathak P，et al.Characterization of the coat protein gene of Cymbidium mosaic virus isolates from India［J］.Journal of Phytopathology，2006，154（5）：275－280.

［13］劉長龍，袁世山.單股正鏈RNA病毒基因組3′非編碼區(qū)功能［J］.中國動物傳染病學(xué)報，2010，18（3）：76－81.

［14］Cheng J H，Ding M P，Hsu Y H，et al.The partial purified RNA－dependent RNA polymerases from bamboo mosaic potexvirus and potato virus X infected plants containing the template－dependent activities［J］.Virus Research，2001，80（1－2）：41－52.

［15］Huang C Y，Huang Y L，Meng M，et al.Sequences at the 3′untranslated region of bamboo mosaic potexvirus RNA interact with the viral RNA－dependent RNA polymerase［J］.Journal of Virology，2001，75（6）：2818－2824.

［16］周國輝，陳曉琴，李梅輝，等.廣東地區(qū)兩種蘭花病毒病害的分子鑒定及檢測［J］.中國病毒學(xué)，2004，19（2）：149－152.

［17］Moles M，Delatte H，F(xiàn)arreyrol K，et al.Evidence that Cymbidium mosaic virus （CymMV）isolates divide into two subgroups based on nucleotide diversity of coat protein and replicase genes［J］.Archives of Virology，2007，152（4）：705－715.