劉昱鋒， 張 錚，2，3＊， 馬銀峰

（1.陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西安 710062；2.陜西師范大學(xué) 藥用資源與天然藥物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 710062；3.西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實(shí)驗(yàn)室，西安 710062）

三葉木通［Akebia trifoliata （Thunb.）Koidz.］為木通科木通屬木質(zhì)藤本植物，原產(chǎn)于中國和日本，在中國分布于山東、河北、山西、陜西、甘肅及長江流域各省［1］。三葉木通全株均可入藥，2010年版《中華人民共和國藥典》收錄其藤莖作為藥用部分，其具有利尿通淋，清心除煩，通經(jīng)下乳的功效［2］，現(xiàn)代藥理學(xué)證明其所含齊墩果酸具有抗腫瘤活性［3］。

為了適應(yīng)中藥現(xiàn)代化的要求，我國一些地方已開展了三葉木通的標(biāo)準(zhǔn)化種植。但在陜西的種植地，連續(xù)三年發(fā)現(xiàn)部分區(qū)域三葉木通葉斑病嚴(yán)重，葉片大量脫落，嚴(yán)重影響藥材的生長。為了明確葉斑病的病原和有效控制葉斑病的發(fā)生和蔓延，提高三葉木通藥材質(zhì)量和產(chǎn)量，本研究對三葉木通人工栽培基地三葉木通葉斑病病原菌進(jìn)行研究，旨在為三葉木通葉斑病的防治和GAP種植實(shí)施提供依據(jù)。

目前國內(nèi)外對于三葉木通病害方面的研究較少。Yoshinori Kobayashi等，根據(jù)三葉木通炭疽病病原菌形態(tài)特征，將其鑒定為尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatumSimmonds ex Simmonds）［4］。梁志懷等人對湖南省長沙的三葉木通褐斑病進(jìn)行了研究，根據(jù)病原菌孢子形態(tài)將其鑒定為鏈格孢屬真菌（Alternariasp.），并進(jìn)行了室內(nèi)防治藥劑篩選［5］。而作者的田間調(diào)查表明，葉斑病癥狀與以前報(bào)道的炭疽病癥狀不同，與褐斑病癥狀與發(fā)展進(jìn)程存在差異。

曾有學(xué)者采用傳統(tǒng)的真菌分類方法，從培養(yǎng)特征與孢子形態(tài)方面對三葉木通病原菌進(jìn)行了鑒定。由于真菌形態(tài)特征的復(fù)雜性與隨環(huán)境變化的不穩(wěn)定性，因此，采用傳統(tǒng)分類法的分析結(jié)果易產(chǎn)生意見分歧。rDNA－ITS區(qū)受到較低的選擇壓力，物種間ITS區(qū)序列表現(xiàn)出較高的差異，其被廣泛應(yīng)用于物種的鑒定［6］。為了彌補(bǔ)傳統(tǒng)分類方法的不足，本研究采用rDNA－ITS區(qū)序列分析結(jié)合病原菌的形態(tài)特征對陜西三葉木通人工栽培地的三葉木通葉斑病進(jìn)行較為科學(xué)的鑒定。

1 材料和方法

1.1 供試試劑

d NTP Mix和Taq DNA 聚合酶購自 TaKaRa公司，DL2000Marker購自西安潤德生物科技有限公司，通用引物ITS1：5′－TCCGATGGTGAACCTGCGG－3′和ITS4：5′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′由上海生物工程有限公司合成，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 病害調(diào)查與癥狀觀察

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期研究，三葉木通葉斑病發(fā)生期為4－9月。從4月末開始，每30d調(diào)查一次，直到9月末停止調(diào)查。隨機(jī)調(diào)查50株，每株分上、中、下共調(diào)查30片葉。統(tǒng)計(jì)病葉率并按下式計(jì)算病情指數(shù)，病情指數(shù)采用國際通用的9級分級標(biāo)準(zhǔn)［7］。觀察病斑的變化，并記錄各時期的癥狀特點(diǎn)。

1.3 病害樣本采集

從栽培地采集具有典型病斑的三葉木通葉片，裝入滅過菌的牛皮紙袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室立即進(jìn)行病原菌的分離。

1.4 病原菌的分離純化

將采集的具有典型癥狀的三葉木通葉斑病葉片，先在70%的乙醇中消毒10～15s，再置于有效氯含量1%的次氯酸鈉中消毒2min左右，無菌水漂洗3次后，切取病健交界處5mm×5mm的組織塊，置于PDA培養(yǎng)基上，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（12h光照／12h黑暗），待菌絲長出后，開始挑取組織塊周圍不同菌絲轉(zhuǎn)接到新的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，通過2～3次連續(xù)的轉(zhuǎn)接純化菌落。對于產(chǎn)孢真菌，采用單孢分離的方法純化；不產(chǎn)孢的真菌，挑取單菌絲片段純化，獲得純的培養(yǎng)物［8］。將純化的真菌4℃下保存，作為待試菌。

1.5 病原菌的致病性測定

按照柯赫氏法則，采用離體葉片無傷接種法，對分離的菌物進(jìn)行接種測定試驗(yàn)，確定葉斑病的致病菌。接種所用的葉片為健康、無任何斑點(diǎn)的幼葉，流水和無菌水將葉片沖洗干凈，滅菌濾紙吸干葉片上殘留的水分，70%酒精棉擦拭葉片表面。將活化培養(yǎng)5d的純分離物菌絲塊置于葉片上，放入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，接種葉片下墊無菌水濕潤的無菌濾紙，25℃保濕培養(yǎng)，以放置培養(yǎng)基塊的葉片為對照，每組接種30片葉片，重復(fù)3次。

葉片接種菌物后，觀察葉片發(fā)病情況，比較接種葉片癥狀與葉斑病原始癥狀，按照上述1.3中方法對發(fā)病葉片的致病菌再分離與純化。將分離的病原物的菌落形態(tài)、菌落顏色、孢子形態(tài)等培養(yǎng)性狀與最初接種分離物進(jìn)行比較，確認(rèn)病害的致病菌。

將致病菌活化培養(yǎng)10d，收集孢子，配成106個／mL的孢子懸浮液。分別采用直接懸滴法和針刺懸滴法接種，每葉定點(diǎn)接種5μL孢子懸浮液，放入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，接種葉片下墊無菌水濕潤的無菌濾紙，25℃保濕培養(yǎng)，以滴加5μL無菌水的葉片為對照，每組接種30片葉，重復(fù)3次［9］。

接種后，觀察葉片發(fā)病情況，比較接種葉片癥狀與葉斑病原始癥狀，按上述1.3中方法對發(fā)病葉片致病菌再分離純化。將分離純化的分離物與接種物進(jìn)行比較，確認(rèn)病害的病原菌。

1.6 病原菌的形態(tài)觀察

活化病原菌，從菌落邊緣取直徑5mm病原菌絲塊置于PDA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)，觀察病原菌在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)、大小、產(chǎn)孢情況、色素分泌等性狀。參照張?zhí)煊睿?0］的方法，挑取少許菌體涂布于PCA＋濾紙上，5d后在顯微鏡下觀察分生孢子梗與分生孢子形態(tài)，并測量其大小，觀察病原菌的產(chǎn)孢表型，將獲得的數(shù)據(jù)與《中國真菌志》（第十六卷）中相關(guān)種的數(shù)據(jù)比對。

1.7 病原菌的分子鑒定

1.7.1 病原菌DNA提取

將病原菌轉(zhuǎn)接到PDA平板上活化培養(yǎng)5d，從菌落邊緣取直徑5mm菌絲塊，接種至PD液體培養(yǎng)基，28℃、150r／min搖床培養(yǎng)3d，收集菌絲，參考楊建雄［11］和張錚［12］提取DNA的方法，在加入 CTAB 提取緩沖液之前，加入洗滌緩沖液（140mmol／L NaCl，200mmol／L Tris－HCl，50mmol／L EDTA，4%β－巰基乙醇），洗去材料中的多糖。其余步驟同CTAB法中的步驟。

1.7.2 病原菌rDNA－ITS區(qū)擴(kuò)增和序列分析

基于前期對病原菌形態(tài)的初步研究，初步認(rèn)為其為鏈格孢屬真菌。根據(jù)孫霞［12］等人對鏈格孢屬rDNA－ITS區(qū)序列的研究，選取PCR擴(kuò)增引物：ITS1：5′－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3′，ITS4：5′－CCTCCGCTTATTGATATGC－3′［14］。PCR反應(yīng)體系：10×Taq buffer 2.5μL、25mmol／L MgCl21.5μL、2.5mmol／L dNTP 2.0μL、10μmol／L正反向引物各2.0μL、20ng／μL DNA模板1μL、5U／μL TaKaRa Taq 0.2μL，補(bǔ)水至總體積25μL。PCR反應(yīng)條件：94℃3min；94℃30s，52℃30s，72℃45s，40個循環(huán)；72℃10min。4℃保存。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物純化及測序由上海生物工程有限公司完成。

將病原菌rDNA－ITS區(qū)序列與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中已登錄注冊的rDNA－ITS區(qū)序列進(jìn)行比對，下載同屬及不同屬形態(tài)上相似的菌株rDNAITS序列［15］。用ClustalX程序?qū)⒃摼昱c同源性較近的菌株的ITS序列在相應(yīng)位置對齊，采用Maximum Likelihood法建立系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 葉斑病田間發(fā)生情況

通過田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該病在4月開始出現(xiàn)，但發(fā)病率低，病情輕；7月后田間葉片的發(fā)病率為100%，6月和7月是該病的快速發(fā)展期；8月至9月病情發(fā)展變慢（見表1）。

表1 三葉木通葉斑病的發(fā)病率與病情指數(shù)Table 1 The incidence and disease index of leaf spot of A.trifoliata

2.2 葉斑病病害癥狀

4月三葉木通葉斑病開始發(fā)生，4月至5月為初期，葉片病部出現(xiàn)紅褐色針尖狀圓點(diǎn)，隨后圓點(diǎn)逐漸擴(kuò)大，紅褐色圓點(diǎn)擴(kuò)大為1～2mm的斑點(diǎn)。6月至7月末為其葉斑病中期，紅褐色圓點(diǎn)逐漸擴(kuò)展成近圓形或多個病斑相接成不規(guī)則形病斑，病斑呈紅褐色或深紅褐色，病健部交界明顯。8月至9月為葉斑病后期，是三葉木通葉斑病嚴(yán)重發(fā)生的時期，病斑進(jìn)一步擴(kuò)大并連成大病斑，病斑呈黑褐色，葉片背面出現(xiàn)霉層（圖1）。發(fā)病嚴(yán)重的植株，整株葉片布滿病斑，且葉片大量脫落，嚴(yán)重影響其光合作用及生長。

圖1 田間病葉不同時期癥狀Fig.1 Symptoms of the diseased leaves at different stages in the field

2.3 病原菌致病性測定

菌絲塊無傷接種幼葉，與對照相比，接種真菌的葉片可以發(fā)病。接種36h后，葉片均表現(xiàn)出感病變化?；疾∪~片表現(xiàn)出的癥狀與田間自然發(fā)病癥狀相似。從接種后發(fā)病的組織再次分離出該致種真菌，菌落形態(tài)、孢子形態(tài)與接種真菌一致。

然后，用該真菌孢子懸浮液接種刺傷的幼葉，48h后葉片開始發(fā)病，發(fā)病率為100%；用該真菌孢子懸浮液接種無傷的幼葉，72h后葉片開始表現(xiàn)出感病變化，發(fā)病率為53.3%（圖2）?；疾∪~片表現(xiàn)出的癥狀與田間自然發(fā)病癥狀相似，而對照未發(fā)病。從接種后發(fā)病的組織再次分離到該致病菌，結(jié)果證明該致病菌為葉斑病的病原菌。

圖2 接種后葉片癥狀Fig.2 The symptoms of the leaves after being inoculated

2.4 病原菌的形態(tài)特征

該病原菌在PDA培養(yǎng)基上菌落平展，絨狀，近圓形。菌落灰白色，邊緣白色，背面褐色（圖3a）。菌絲灰白色，具隔分支。分生孢子梗分化明顯，單生或簇生，直或略彎，分隔，偶分支，淡褐色；分生孢子串生，形狀有近橢圓形、卵形、倒棒狀形，淡褐色到黃褐色，分生孢子光滑或極少數(shù)具瘤。在PCA＋濾紙上，成熟的分生孢子具有4～7個橫隔膜，縱或斜隔膜0～4個，常有1～4個主橫隔膜因較粗而色深，分生孢子大小為（21.93～44.63）μm×（7.80～11.62）μm。喙以及柱狀假喙，顏色比孢身淺，無隔膜或有1個隔膜，喙大小為（3.2～12.15μm）×（2.0～4.00）μm（圖3b）。在PCA＋濾紙培養(yǎng)中，5d內(nèi)可形成超過10個孢子連接而成的鏈狀，多數(shù)孢子只在假喙頂端次生產(chǎn)孢，個別分生孢子側(cè)向次生產(chǎn)孢，多數(shù)分生孢子長鏈不分支，個別孢子鏈有側(cè)鏈，側(cè)鏈上1～5個孢子串生（圖3c）。分生孢子梗從主菌絲上直接產(chǎn)生，直立，偶分支、分隔、淡褐色。

根據(jù)孢子形態(tài)特征，結(jié)合《中國真菌志》，可將病原菌初步鑒定為半知菌亞門（Deuteromycotina），絲孢綱（Hyphomycetes），絲孢目（Hyphomycetales），暗色菌科（Dematiaceae），鏈格孢屬（Alternaria），結(jié)合其產(chǎn)孢表型進(jìn)一步將其鑒定為細(xì)極鏈格孢［Alternaria tenuissima（Fr.）Wiltshire］。

圖3 病原菌形態(tài)特征Fig.3 Morphology of the pathogen

2.5 三葉木通病原菌rDNA－ITS區(qū)擴(kuò)增和序列分析

以病原菌DNA為模板，用真菌通用引物ITS1／ITS4對其rDNA－ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一個長度為541bp的擴(kuò)增片段（圖4）。將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，得到rDNA－ITS區(qū)序列。用BLAST在GenBank中搜索同源序列，進(jìn)行比對和分析。該菌株與細(xì)極鏈格孢［Alternaria tenuissima（Fr.）Wiltshire］（JN986764.1）相似性為99%，所得分值為977；與鏈 格 孢 ［Alternaria alternata（Fr：Fr.）Keissler］（JN618076.1）和 蕓 苔 鏈 格 孢 ［Alternaria brassicae（Berk.）Sacc.］（JN108903.1）的相似性為99%，所得分值為974；與蔥鏈格孢［Alternaria porri（Ellis）Ciferri］（JF422730.1）相似性均為99%，所得分值為966。該病原菌與已登錄注冊的細(xì)極鏈格孢（A.tenuissima）（GenBank登錄號JN986764.1）比對所得分值最大，相似度最高。構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹中，聚類結(jié)果顯示，該病原菌（聚類圖中以The pathogen代替）與A.tenuissima、A.alternata、A.brassicae、A.porri聚為一類（見圖5），而與另外的鏈格孢屬不同菌株及另外兩個形態(tài)相似屬菌株分開。

圖4 rDNA－ITS區(qū)擴(kuò)增片段電泳圖Fig.4 Electrophoretogram of rDNA－ITS PCR products

圖5 病原菌rDNA－ITS區(qū)系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.5 Phylogenetic analysis of the pathogen based on rDNA－ITS sequences

3 討論

目前報(bào)道的三葉木通病害為炭疽病和褐斑病。炭疽病開始癥狀為褐色壞死小斑，隨后，病斑中央變?yōu)闇\灰白色，潮濕條件下，病斑上出現(xiàn)包含橙色到橙紅色孢子的子實(shí)體。褐斑病有時微顯輪紋，隨著病斑數(shù)量增多、面積增大，一些病斑可相互連成不規(guī)則的大病斑，葉片成為畸形。褐斑病的癥狀與葉斑病癥狀存在差異，葉斑病病斑無輪紋，發(fā)病葉片為正常形態(tài)，但這兩種病害病癥所表現(xiàn)的顏色很相近。通過對鎮(zhèn)安人工栽培地三葉木通葉斑病病原菌的分離與初步形態(tài)鑒定，發(fā)現(xiàn)葉斑病病原菌為鏈格孢屬中的一種。

在本研究菌株的分子鑒定中，該菌株序列與鏈格孢、蕓苔鏈格孢、細(xì)極鏈格孢等的序列相似性均為99%，僅借助ITS序列無法將該菌株準(zhǔn)確鑒定到種。準(zhǔn)確鑒定該病原菌需結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)特征，尤其是產(chǎn)孢表型。這與孫霞［13］等人的研究結(jié)果相似，rD－NA－ITS區(qū)段DNA序列差異對鏈格孢（特別小孢子種）提供的遺傳信息少，其進(jìn)化未達(dá)到判定種間差異的程度，不能單獨(dú)作為鏈格孢種級分類的有效手段，必須結(jié)合其顯微形態(tài)特征。

根據(jù)張?zhí)煊钪骶幍摹吨袊婢尽罚ǖ谑恚?0］，鏈格孢（A.alternata）具特征性的短分支的孢子鏈，一般做合軸式延伸，孢子鏈類似小樹叢狀；蕓苔鏈格孢（A.brassicae）具有橫隔6～11個，孢子單生；蔥鏈格孢（A.porri）具有橫隔5～11個，孢子單生，罕見鏈生；而我們分離到的該菌株孢子橫隔數(shù)為4～7個，5d內(nèi)可形成超過10個孢子連成的孢子鏈，主鏈上罕見分支，這與Alternaria tenuissima（Fr.）Wiltshire的孢子形態(tài)及產(chǎn)孢表型相同。在blast序列比對結(jié)果中，該病原菌與登錄號為JN986764.1的一株A.tenuissima最為相似；雖然聚類分析顯示該病原菌與A.tenuissima、A.alternata、A.brassicae、A.porri聚為一類，但結(jié)合4株鏈格孢屬真菌的孢子形態(tài)特征及產(chǎn)孢表型可將它們準(zhǔn)確區(qū)分開。所以綜上所述，將該病原菌鑒定為半知菌亞門，絲孢綱，絲孢目，暗色孢科，鏈格孢屬的細(xì)極鏈格孢（A.tenuissima）。

本研究通過病原菌的產(chǎn)孢表型與rDNA－ITS區(qū)序列對其準(zhǔn)確鑒定，為其有效的防治與深入研究提供了重要基礎(chǔ)。

［1］ 中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志（第二十九卷）［M］.北京：科學(xué)出版社，2001：4－9.

［2］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（2010年版一部）［M］.上海：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：59.

［3］ 高慧敏，王智民.木通屬藥用植物研究進(jìn)展［J］.中國中藥雜志，2006，31（1）：10－14.

［4］ Yoshinori Kobayashi，Takanori Tsukamoto，Naohiko Miyai，et al.Anthracnose of three－leaf akebia （Akebia trifoliata Koidzumi）caused by Colletotrichum acutatum［J］.Journal of General Plant Pathology，2004，70（5）：295－296.

［5］ 梁志懷，魏林，彭俊彩，等.人工栽培三葉木通褐斑病病原菌鑒定及防治藥劑室內(nèi)篩選［J］.植物保護(hù)，2009，35（4）：158－161.

［6］ 陳劍山，鄭服叢.ITS序列分析在真菌分類鑒定中的應(yīng)用［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（13）：3785－3786.

［7］ 徐文耀.普通植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)［M］.北京：科學(xué)出版社，2006：122－123.

［8］ 方中達(dá).植病研究方法［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2007：122－145.

［9］ 劉芳，高原，張競頤，等.北京地區(qū)非洲菊葉斑病病原菌鑒定［J］.菌物學(xué)報(bào)，2010，29（1）：22－26.

［10］張?zhí)煊?中國真菌志（第十六卷）［M］.北京：科學(xué)出版社，2003：1－200.

［11］楊建雄.生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)教程（第二版）［M］.北京：科學(xué)出版社，2009：92－93.

［12］張錚，王強(qiáng).三葉木通總DNA提取方法的比較［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2005，14（3）：141－144.

［13］孫霞.鏈格孢屬真菌現(xiàn)代分類方法研究［D］.泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006：98－117.

［14］White T J，Bruns T，Lee S.Analysis of phytogenetic relationships by amplification and direct sequencing of ribosomal RNA genes［M］∥Innis M A，Gelfand D H，Sninsky J J，et al.PCR protocols：A guide to methods and applications.San Diego：Academic Press，1990：315－322.

［15］沈瑞清，康萍芝，張麗榮.鏈格孢屬Alternaria nees與形態(tài)相似屬區(qū)別的研究進(jìn)展［J］.寧夏農(nóng)業(yè)科技，2003（6）：60－62.