徐 怡，陳光明，宓現(xiàn)強(qiáng)

(1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093;2.中國(guó)科學(xué)院上海高等研究院，上海 201210)

惡性腫瘤是一種死亡率很高的疾病，2005年全球死亡人數(shù)5800萬(wàn)中死于癌癥的760萬(wàn)，占總數(shù)13%[1-2]。據(jù)世界衛(wèi)生組織最近發(fā)表《世界癌癥報(bào)告》說(shuō)，今后數(shù)年將是全球癌癥高發(fā)年份，如各國(guó)不采取緊急措施，到2020年全世界癌癥發(fā)病率將比現(xiàn)在增加50%，全球每年新增患者人數(shù)將達(dá)1500萬(wàn)人。解決腫瘤高死亡率的途徑之一是對(duì)腫瘤進(jìn)行有效的控制和預(yù)防，而控制和預(yù)防最大的難題是如何能盡可能早的發(fā)現(xiàn)腫瘤，從而針對(duì)性的采用最有效的手段進(jìn)行治療。

腫瘤患者死亡率的不斷升高，使得越來(lái)越多的研究人員致力于腫瘤研究，在其診斷和治療方面取得了不少進(jìn)展，其中腫瘤診斷方面，miRNA作為一種新的腫瘤標(biāo)志物是腫瘤診斷研究的熱點(diǎn)。

一、腫瘤標(biāo)志物的新熱點(diǎn)——miRNA及其檢測(cè)技術(shù)

1.miRNA簡(jiǎn)介及優(yōu)勢(shì) miRNA(microRNA，微小RNA)是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)內(nèi)源性的非編碼小分子RNA，存在于不同生物中，在Drosha R Nase的作用下由pri-miRNA剪切成為70～100個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的pre-miRNA，pre-miRNA在Dicer酶作用下被剪切成19～25個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的成熟 RNA，即 miRNA[3]。成熟miRNA通過(guò)與目標(biāo)mRNA的3'端非編碼區(qū)(3'untranslated region，3'UTR)特異性互補(bǔ)，導(dǎo)致mRNA翻譯受到抑制[4]。miRNA具有廣泛的基因調(diào)節(jié)功能，據(jù)統(tǒng)計(jì)miRNA調(diào)節(jié)了人類(lèi)30%基因功能[3]，參與了一系列生命活動(dòng)，包括細(xì)胞增殖及凋亡、器官形成、造血過(guò)程、發(fā)育進(jìn)程等，與腫瘤的發(fā)生、診斷、治療和預(yù)后等有著密切關(guān)系，腫瘤中超過(guò)50%的miRNAs基因位于染色體脆性位點(diǎn)或染色體擴(kuò)增、缺失或轉(zhuǎn)位區(qū)域[5]，相比于蛋白質(zhì)標(biāo)志物，miRNA表達(dá)異常出現(xiàn)的更早(圖1)，對(duì)早期診斷更加有利，也更適合作為作為腫瘤診斷標(biāo)志物，從而成為研究熱點(diǎn)之一[6-8]。

圖1 腫瘤過(guò)程及生物標(biāo)志物的確定

腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)是真正能夠?qū)崿F(xiàn)腫瘤早期診斷的方法，miRNA的診斷優(yōu)勢(shì)從以下實(shí)驗(yàn)事例中有充分體現(xiàn)，Maitra A等[9]的一項(xiàng)研究表明血清中miRNA能很好的區(qū)分腫瘤患者和健康人群，這為在血漿或血清中檢查miRNA表達(dá)的變化情況，為基于血液樣品的人類(lèi)癌癥檢測(cè)提供了依據(jù)。Mitchell，P.S 等[10]試圖通過(guò)實(shí)驗(yàn)方法確定來(lái)源于血漿和血清樣本的miRNA是否會(huì)有本質(zhì)的不同，該實(shí)驗(yàn)組的檢測(cè)樣本來(lái)自同一患者的同一次抽血。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明無(wú)論對(duì)血漿還是血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，miRNA都可以作為基于血液檢測(cè)的穩(wěn)定的標(biāo)志物。Keller等[11]對(duì)臨床454例不同疾病患者血清樣本進(jìn)行芯片分析，包括肺癌、前列腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胃癌、腎母細(xì)胞瘤、胰腺腫瘤等腫瘤患者以及對(duì)照個(gè)體。結(jié)果顯示863種miRNAs中有多達(dá)62種miRNA在6種疾病中表達(dá)下調(diào);24種miRNA在14種疾病中表達(dá)下調(diào);同時(shí)也有121種miRNA在所有的14種疾病中正常表達(dá)。這一研究結(jié)果說(shuō)明miRNA對(duì)于腫瘤有很好的顯示作用，使得根據(jù)血清中miRNA的表達(dá)情況確定患者患病情況成為可能。Hennessey，P.T等[12]針對(duì)非小細(xì)胞肺癌的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清中的2種miRNA:miR-15b和miR-27b的不同表達(dá)情況能夠很好的區(qū)分非小細(xì)胞肺癌和健康人群，并且特異性很高。該研究結(jié)果不僅證實(shí)了前人對(duì)于循環(huán)miRNA對(duì)篩查非小細(xì)胞肺癌有很重要的作用[12-14]的結(jié)論.同時(shí)也充分顯示血清中miRNA的不同表達(dá)情況對(duì)于非小細(xì)胞肺癌來(lái)說(shuō)具有很高的診斷價(jià)值，并且可能成為患者確診前的最有效的診斷依據(jù)。上述幾例實(shí)驗(yàn)充分證明miRNA是特異性很強(qiáng)的腫瘤早期診斷標(biāo)志物。Rui Liu等[15]用197例胰腺癌血清樣本，對(duì)胰腺癌早期標(biāo)志物進(jìn)行研究，結(jié)果顯示該研究組所選擇的7種miRNA同時(shí)檢測(cè)的準(zhǔn)確率為86.3%，而單獨(dú)的糖類(lèi)抗原(CA)19-9檢測(cè)準(zhǔn)確率為56.4%，癌胚抗原(CEA)僅為36.4%。這充分說(shuō)明miRNA相比于蛋白類(lèi)標(biāo)志物具有優(yōu)勢(shì)，也從另一方面說(shuō)明多個(gè)靶分子同時(shí)檢測(cè)的重要性。

從上述實(shí)驗(yàn)事例可以看出miRNAs表達(dá)異常對(duì)腫瘤有很好的鑒別作用[5，16-17]。這為腫瘤實(shí)現(xiàn)早期診斷提供了方向。miRNA不僅在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到了重要的作用，可以作為癌癥診斷和預(yù)后判斷的重要標(biāo)志物。同時(shí)miRNA具有以下五大優(yōu)點(diǎn):(1)miRNA在正常人外周血中表達(dá)穩(wěn)定且可以穩(wěn)定存在，無(wú)顯著的個(gè)體差異[18-21];(2)血清或血漿中miRNA在室溫下孵育24 h或者以上、反復(fù)凍融(可高達(dá)8個(gè)凍融周期)、過(guò)酸、過(guò)堿、甚至煮沸條件下不易降解[22-28，10];(3)miRNA 表達(dá)水平的變化與惡性腫瘤的病理過(guò)程密切相關(guān);(4)血清中miRNA的異常表達(dá)可作為腫瘤細(xì)胞存在的直接證據(jù)，具有很好的生物學(xué)標(biāo)志物價(jià)值[29-31];(5)miRNA相比于蛋白標(biāo)志物不僅檢測(cè)準(zhǔn)確率更高，且更易于實(shí)現(xiàn)多組分同時(shí)檢測(cè)，優(yōu)越性明顯。

2.生物信息學(xué)在miRNA標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)及優(yōu)化中的作用 近年來(lái)隨著對(duì)miRNA研究的增多，不同物種中數(shù)以百計(jì)的miRNA已直接由克隆技術(shù)和計(jì)算方法確定，但是仍有很多miRNA由于相對(duì)分子質(zhì)量較小或者序列特異性等問(wèn)題不能僅僅依靠序列信息就可以確定，而是需要了解miRNA前體的結(jié)構(gòu)信息才可以確定[32-33]。生物信息學(xué)在這方面是一種非常有價(jià)值的研究方法[34]。生物信息學(xué)通過(guò)計(jì)算機(jī)和信息技術(shù)結(jié)合，對(duì)生物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和計(jì)算，對(duì)于實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一種非常有價(jià)值的補(bǔ)充。Mizuguchi，Y等[35]研究表明通過(guò)生物信息學(xué)所確定的miRNA相比于個(gè)體miRNA研究或者其他臨床病理研究等方法，對(duì)于高危人群的預(yù)后狀況分析效果更好。因此生物信息學(xué)技術(shù)能夠成為生物知識(shí)和臨床治療之間相結(jié)合的橋梁。生物信息學(xué)及其相關(guān)技術(shù)能夠促進(jìn)新的靶點(diǎn)的快速識(shí)別，從而可以推進(jìn)研究更快的進(jìn)入到實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證階段[36]。

同時(shí)生物信息學(xué)在多靶點(diǎn)的確定方面有著不可忽視的作用。目前臨床上對(duì)于腫瘤標(biāo)志物診斷方法仍多為單組份檢測(cè)，而單組份檢測(cè)存在特異性不高、靈敏度不強(qiáng)等缺陷，多組分同時(shí)檢測(cè)恰恰能夠克服單組份檢測(cè)的缺陷，靈敏度和特異性都有很大的提高。本文前面所提到Rui Liu等的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也說(shuō)明多組分相比于單組份的優(yōu)勢(shì)，而尋找同時(shí)檢測(cè)的多組分靶點(diǎn)也成為了非常重要的一部分，生物信息學(xué)對(duì)于新型標(biāo)志物miRNA的確定以及多靶點(diǎn)的組合方面有重要作用，根據(jù)生物信息學(xué)計(jì)算結(jié)果結(jié)合相關(guān)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)可以更快的確定腫瘤標(biāo)志物最佳組合，從而更快的推動(dòng)腫瘤標(biāo)志物多組分同時(shí)檢測(cè)。

3.用于腫瘤早期診斷的miRNA檢測(cè)技術(shù) 在腫瘤的早期診斷中，除了標(biāo)志物的選擇和檢測(cè)樣本的確定外，檢測(cè)方法也是提高腫瘤檢測(cè)特異性的一個(gè)很重要方面。目前miRNA的檢測(cè)有以下幾種方法，熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR)、熒光原位雜交(FISH)等。其中RT-PCR檢測(cè)方法最為常用，主要分為探針?lè)ê腿玖戏?種，由于miRNA在血清中濃度低，因此反應(yīng)所需循環(huán)次數(shù)多，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。目前國(guó)內(nèi)腫瘤核酸定量檢測(cè)試劑盒仍處于科學(xué)研究階段;FISH相對(duì)簡(jiǎn)單，國(guó)內(nèi)外已有腫瘤組織細(xì)胞檢測(cè)試劑盒，然而miR-NAs原位檢測(cè)系統(tǒng)相對(duì)較少，主要的原因是低拷貝、片段小。

分子信標(biāo)檢測(cè)技術(shù)是能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)miRNA進(jìn)行簡(jiǎn)便快速檢測(cè)的檢測(cè)方法。分子信標(biāo)是一段寡核苷酸，主要由4個(gè)部分組成:環(huán)、莖、熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)，分子信標(biāo)具有能夠很好的和靶點(diǎn)miRNA特異性結(jié)合的特點(diǎn)，因此只有當(dāng)檢測(cè)樣本中存在檢測(cè)靶點(diǎn)，分子信標(biāo)才會(huì)與之結(jié)合，與此同時(shí)，分子信標(biāo)熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)打開(kāi)，從而可以檢測(cè)到熒光的存在。這一特點(diǎn)使得檢測(cè)的特異性大大提高。普通分子信標(biāo)常用的熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)為傳統(tǒng)有機(jī)染料，但是有機(jī)染料存在著吸收光譜較寬，而發(fā)射光譜較窄、抗光漂白性較差等缺點(diǎn)[37]。為此，近年來(lái)很多學(xué)者和專(zhuān)家開(kāi)始更多的關(guān)注量子點(diǎn)技術(shù)。

量子點(diǎn)是一種無(wú)機(jī)納米材料，具有發(fā)光強(qiáng)度強(qiáng)，經(jīng)過(guò)測(cè)定單個(gè)量子點(diǎn)比有機(jī)染料明亮大概10～20倍[38-39]、且具有發(fā)射波長(zhǎng)可以由自身尺寸大小變化而變化等優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)不同尺寸的量子點(diǎn)與分子信標(biāo)結(jié)合能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)多種miRNA的同時(shí)檢測(cè)。將量子點(diǎn)和分子信標(biāo)技術(shù)結(jié)合，能夠使兩者優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，非常便于實(shí)現(xiàn)建立快速、簡(jiǎn)便、高效的腫瘤標(biāo)志物早期診斷新技術(shù)，對(duì)腫瘤的早期診斷的實(shí)現(xiàn)有重大的意義。

三、總結(jié)

綜上所述，腫瘤診斷方面影像學(xué)有不可忽視的作用，但是由于自身局限性很難實(shí)現(xiàn)早期診斷，而傳統(tǒng)標(biāo)志物診斷由于特異性不強(qiáng)，靈敏度不高而影響診斷效果。檢測(cè)標(biāo)志物、檢測(cè)對(duì)象及檢測(cè)方法共同決定了惡性腫瘤的早期診斷效果，miRNA、生物信息學(xué)以及分子信標(biāo)檢測(cè)技術(shù)三者相結(jié)合，對(duì)于實(shí)現(xiàn)惡性腫瘤早期診斷有巨大的推動(dòng)作用。

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