湯榮華， 黃建軍

(皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院檢驗(yàn)科，安徽蕪湖 241001)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以累及周圍關(guān)節(jié)為主的多系統(tǒng)性炎癥性自身免疫性疾病，其典型癥狀為對(duì)稱性、多個(gè)周圍性關(guān)節(jié)的慢性炎癥病變，病變呈持續(xù)、反復(fù)發(fā)作的過程，其病理為滑膜炎，侵襲下層關(guān)節(jié)軟骨及骨，造成關(guān)節(jié)破壞。RA的病因和病理機(jī)制尚未完全闡明，多種源自免疫系統(tǒng)和滑膜組織的細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子參與了疾病的發(fā)展。近來有文獻(xiàn)報(bào)道，炎癥因子網(wǎng)絡(luò)持續(xù)的激活/調(diào)節(jié)異常與自身抗原刺激的免疫反應(yīng)一起，成為RA患者關(guān)節(jié)慢性炎癥持續(xù)存在的主要因素［1-4］。鑒于細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)在RA患者關(guān)節(jié)慢性炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵作用，外周循環(huán)血或關(guān)節(jié)液中的細(xì)胞因子可能成為監(jiān)控病情發(fā)展和判斷預(yù)后的良好指標(biāo)。本研究立足于RA慢性炎癥的最新報(bào)道，檢測(cè)中性粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、白細(xì)胞介素17(IL-17)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)在RA患者外周血中的水平，評(píng)價(jià)這些細(xì)胞因子與RA病情發(fā)展的相關(guān)性。

材料和方法

一、研究對(duì)象

活動(dòng)期RA患者45例，其中男14例，女31例，年齡(51.5±5.62)歲;穩(wěn)定期 RA 患者36例，其中男9 例，女27 例，年齡(49.6±7.52)歲;健康對(duì)照組50名，為正常體檢健康者，性別、年齡與患者組相匹配。RA患者活動(dòng)判斷標(biāo)準(zhǔn):(1)關(guān)節(jié)腫脹≥6個(gè);(2)關(guān)節(jié)壓痛≥6個(gè);(3)晨僵≥45 min;(4)紅細(xì)胞沉降率(ESR)≥40 mm/h;(5)C反應(yīng)蛋白(CRP)＞15 mg/L。RA患者存在(1)+(2)同時(shí)伴有(3)、(4)、(5)3項(xiàng)的任何2項(xiàng)被認(rèn)為活動(dòng);不同時(shí)滿足(1)+(2)或(3)、(4)、(5)僅1項(xiàng)被認(rèn)為不活動(dòng)或活動(dòng)度低。

二、方法

GM-CSF、IL-6、IL-17 和TNF-α的檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，GM-CSF、IL-6、IL-17 和TNF-α試劑盒均由美國(guó)RB公司提供，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。應(yīng)用Bio-RAD酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm處吸光度(A)值，并將其在標(biāo)準(zhǔn)曲線下?lián)Q算成濃度值。CRP采用免疫比濁法檢測(cè)。

RA患者病情活動(dòng)度的評(píng)估采用ESR式疾病活性分?jǐn)?shù) 28(DAS28)，DAS28=［0.56×sqrt(T28)+0.28×sqrt(SW28)+0.7×Ln(ESR)］×1.08+0.16，數(shù)值范圍為0～10。其中，T28 表示雙側(cè)近端指間關(guān)節(jié)、掌指關(guān)節(jié)、腕關(guān)節(jié)、肘關(guān)節(jié)、肩關(guān)節(jié)及膝關(guān)節(jié)共計(jì)28個(gè)關(guān)節(jié)觸痛或被動(dòng)活動(dòng)時(shí)的觸痛數(shù);SW28表示上述28個(gè)關(guān)節(jié)的腫脹數(shù)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，由于原始數(shù)據(jù)呈輕度偏態(tài)分布，計(jì)量資料用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示，對(duì)每個(gè)值進(jìn)行換，轉(zhuǎn)換后按正態(tài)分布數(shù)據(jù)處理，采用±s表示。各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)或 t檢驗(yàn)，多重比較采用Bonforroni檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、CRP、ESR水平及DAS28比較

CRP、ESR水平和DAS28在研究對(duì)象間的比較見表1，活動(dòng)期RA患者組3項(xiàng)指標(biāo)均顯著高于靜止期RA患者及健康對(duì)照組(P＜0.05)。

表1 CRP、ESR和DAS28在研究對(duì)象間的比較

二、研究對(duì)象血清GM-CSF、IL-6、IL-17 和TNF-α水平的比較

活動(dòng)期 RA患者血清中GM-CSF、IL-6和TNF-α的水平顯著高于靜止期RA患者和健康對(duì)照組(P＜0.01);靜止期 RA患者血清中GMCSF、IL-6和TNF-α的水平顯著高于健康對(duì)照組(P＜0.05)，IL-17在3組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

三、4種細(xì)胞因子及DAS28的相關(guān)性分析

4種細(xì)胞因子均有顯著的正相關(guān)性，其中GMCSF與TNF-α和IL-6的相關(guān)系數(shù)較高，與IL-17的相關(guān)系數(shù)較低，DAS28與TNF-α、IL-6和GM-CSF均有顯著的相關(guān)性。見表3。

表2 3組血清GM-CSF、IL-6、IL-17和TNF-α水平的比較 (pg/mL)

表3 4種細(xì)胞因子及DAS28在研究對(duì)象間的相關(guān)性分析 ［r值(P值)］

討 論

本研究比較巨噬細(xì)胞源性細(xì)胞因子(GMCSF、IL-6和TNF-α)和Th17細(xì)胞源性細(xì)胞因子(IL-17)在靜止期和活動(dòng)期RA患者體內(nèi)的水平，分析4種細(xì)胞因子之間的相互關(guān)系及其與RA患者疾病活動(dòng)度之間的關(guān)系。GM-CSF、IL-6和TNF-α在活動(dòng)期RA患者外周血中的濃度均顯著高于靜止期RA患者和健康對(duì)照者，而IL-17在3組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)在RA患者慢性關(guān)節(jié)炎的持續(xù)發(fā)作中發(fā)揮重要作用，而 Th17細(xì)胞在病情的維持中可能無(wú)明顯作用。

GM-CSF是由內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和活化的T細(xì)胞在細(xì)菌脂多糖(LPS)、白細(xì)胞介素1(IL-1)和TNF-α等炎癥因子的刺激下分泌的一種細(xì)胞因子，最初認(rèn)為GM-CSF促進(jìn)骨髓前體細(xì)胞增殖分化為巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞(DC)［5-7］。近來的研究表明，GM-CSF 調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的多種功能，包括細(xì)胞黏附、病原模式識(shí)別受體的表達(dá)、促進(jìn)炎癥因子［白細(xì)胞介素12(IL-12)、白細(xì)胞介素 18(IL-18)、IL-6 和TNF-α)］的分泌以及吞噬和殺滅病原體。GM-CSF對(duì)于自身免疫性疾病的產(chǎn)生具有重要的作用，GM-CSF基因敲除的骨髓細(xì)胞發(fā)育分化良好，不易發(fā)展成為實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性腦炎、膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎以及實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌炎，GM-CSF抗體能夠避免或緩解動(dòng)物自身免疫性炎癥的發(fā)生［8-11］。RA患者關(guān)節(jié)滑膜液和血漿中GM-CSF及其受體濃度升高，滑膜組織細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、外周血單個(gè)核細(xì)胞胞內(nèi)GM-CSF受體過度表達(dá)［12］，表明 GM-CSF在RA慢性關(guān)節(jié)炎中具有重要作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，GM-CSF能夠緩解Felty's綜合征以及化療引起的粒細(xì)胞減少，同時(shí)卻促進(jìn)了關(guān)節(jié)炎的復(fù)發(fā)。本研究發(fā)現(xiàn)，GM-CSF在活動(dòng)期RA患者外周血中的水平為27.4(34.8)pg/mL，顯著高于靜止期 RA 患者［12.7(9.7)pg/mL］和健康對(duì)照者［6.2(5.2)pg/mL］;靜止期RA患者的GM-CSF濃度也高于健康對(duì)照者，表明GM-CSF可能是促進(jìn)并維持RA關(guān)節(jié)滑膜炎的重要細(xì)胞因子，隨著GM-CSM濃度的增加，RA患者關(guān)節(jié)炎呈現(xiàn)活躍狀態(tài)。我們同時(shí)發(fā)現(xiàn)IL-6和TNF-α在RA患者外周血中的水平顯著高于健康對(duì)照組，活動(dòng)期RA患者顯著高于靜止期RA患者，表明細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)在RA關(guān)節(jié)炎活動(dòng)期處于激活狀態(tài)，巨噬細(xì)胞活化并分泌相關(guān)細(xì)胞因子，促進(jìn)關(guān)節(jié)炎癥的反復(fù)發(fā)作。聯(lián)合檢測(cè)血清中GM-CSF、IL-6和TNF-α的水平有助于RA患者病情活動(dòng)度的監(jiān)測(cè)。

IL-17是Th17細(xì)胞分泌的主要細(xì)胞因子，IL-17可通過誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子、蛋白酶和黏附分子的產(chǎn)生發(fā)揮其在RA中的作用。IL-17通過核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)等細(xì)胞通路來促進(jìn)多種細(xì)胞因子分泌，包括IL-6、IL-8 及 TNF-α等［13-14］;同時(shí)IL-17能夠誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生和成熟。IL-17單獨(dú)或與IL-1β/TNF-α等協(xié)同刺激關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞表達(dá)IL-6，這些細(xì)胞因子募集炎性細(xì)胞，使巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、幼稚DC細(xì)胞和T細(xì)胞等在關(guān)節(jié)滑膜處聚集，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，加快滑膜細(xì)胞增殖［15-16］;而且IL-17能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-3、MMP-9 及MMP-13［17］，促進(jìn)軟骨蛋白多糖及膠原降解，增強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞對(duì)軟骨基質(zhì)的破壞［18-19］。IL-17可以通過上述多種途徑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)的破壞，然而本研究表明，IL-17在活動(dòng)期和靜止期RA患者外周血中的濃度分別為23.4(19.5)和19.3(16.4)pg/mL，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與健康對(duì)照組的濃度20.8(16.1)pg/mL相比差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示IL-17在RA誘導(dǎo)期和發(fā)病期作用是不同的，IL-17可能僅參與RA誘發(fā)，與RA關(guān)節(jié)滑膜炎的反復(fù)發(fā)作可能無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。IL-17在慢性關(guān)節(jié)滑膜炎癥維持中的作用還有待闡明［20］。

我們同時(shí)對(duì)RA患者血清中4種細(xì)胞因子間以及與DAS28分?jǐn)?shù)的相關(guān)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)4種因子間均呈正相關(guān)關(guān)系，其中GM-CSF與TNF-α和IL-6的相關(guān)系數(shù)最高(r=0.738、0.637)，與IL-17的相關(guān)系數(shù)較低(r=0.171);GM-CSF與DAS28也具有較強(qiáng)的相關(guān)性(r=0.583)，表明GM-CSF與RA疾病活動(dòng)度有密切關(guān)聯(lián)。這種相關(guān)性提示GM-CSF可能是炎癥因子網(wǎng)絡(luò)中的核心調(diào)控者。T細(xì)胞識(shí)別關(guān)節(jié)組織特異性抗原，誘發(fā)炎癥，分泌 GM-CSF等細(xì)胞因子［21］，在關(guān)節(jié)滑膜炎中，GM-CSF募集骨髓中的單核細(xì)胞和粒細(xì)胞，在關(guān)節(jié)處發(fā)育分化，分泌大量 TNF-α和IL-6，促進(jìn)關(guān)節(jié)炎癥的發(fā)展;而在靜止期，RA患者GMCSF的濃度降低，募集的單核細(xì)胞和粒細(xì)胞減少，分泌的TNF-α和IL-6也隨之降低，關(guān)節(jié)炎癥呈現(xiàn)恢復(fù)趨勢(shì)。

總之我們的研究表明，細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)是維持和促進(jìn)RA關(guān)節(jié)滑膜炎的重要因素，GM-CSF、IL-6及TNF-α的水平有助于判斷RA的活動(dòng)度;GMCSF與疾病活動(dòng)度及血清中IL-6和TNF-α的水平均呈正相關(guān)，可能是RA患者細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的重要調(diào)控者，GM-CSF在RA發(fā)病過程中的作用有待深入研究。

［1］Smolen JS，Steiner G.Rheumatoid arthritis is more than cytokines:autoimmunity and rheumatoid arthritis［J］.Arthritis Rheum，2001，44(10):2218-2220.

［2］Steiner G，Smolen J.Autoantibodies in rheumatoid arthritis and their clinical significance［J］.Arthritis Res，2002，4(Suppl 2):S1-S5.

［3］Firestein GS，Zvaifler NJ.How important are T cells in chronic rheumatoid synovitis?:Ⅱ.T cellindependent mechanisms from beginning to end［J］.Arthritis Rheum，2002，46(2):298-308.

［4］Feldmann M.Development of anti-TNF therapy for rheumatoid arthritis［J］.Nat Rev Immunol，2002，2(5):364-371.

［5］Kunisada T，Miyazaki M，Mihara K，etal.A new human chondrosarcoma cell line(OUMS-27)that maintains chondrocytic differentiation［J］.Int J Cancer，1998，77(6):854-859.

［6］Altman R，Asch E，Bloch D，etal.Development of criteria for the classification and reporting of osteoarthritis.Classification of osteoarthritis of the knee.Diagnostic and Therapeutic Criteria Committee of the American Rheumatism Association［J］.Arthritis Rheum，1986，29(8):1039-1049.

［7］Arnett FC，Edworthy SM，Bloch DA，etal.The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis［J］.Arthritis Rheum，1988，31(3):315-324.

［8］Shimada S，Nakamura M，Tanaka Y.Crosslinking of the CD69 molecule enhances S100A9 production in activated neutrophils［J］.Microbiol Immunol，2007，51(1):87-98.

［9］Tschesche H，Z?lzer V，Triebel S，etal.The human neutrophil lipocalin supports the allosteric activation of matrix metalloproteinases［J］.Eur J Biochem，2001，268(7):1918-1928.

［10］Yan L，Borregaard N，Kjeldsen L，etal.The high molecular weight urinary matrix metalloproteinase(MMP)activity is a complex of gelatinase B/MMP-9 and neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL).Modulation of MMP-9 activity by NGAL［J］.JBiol Chem，2001，276(40):37258-37265.

［11］Koch G，Wagner T，Plater-Zyberk C，etal.Multiresponse model for rheumatoid arthritis based on delay differential equations in collagen-induced arthritic mice treated with an anti-GM-CSF antibody［J］.JPharmacokinet Pharmacodyn，2012，39(1):55-65.

［12］Nakano K，Okada Y，Saito K，etal.Rheumatoid synovial endothelial cells produce macrophage colonystimulating factor leading to osteoclastogenesis in rheumatoid arthritis［J］.Rheumatology(Oxford)，2007，46(4):597-603.

［13］Granet C，Miossec P.Combination of the proinflammatory cytokines IL-1，TNF-alpha and IL-17 leads to enhanced expression and additional recruitment of AP-1 family members，Egr-1 and NF-kappaB in osteoblast-like cells ［J］.Cytokine，2004，26(4):169-177.

［14］Bush KA，F(xiàn)armer KM，Walker JS，etal.Reduction of joint inflammation and bone erosion in rat adjuvant arthritis by treatment with interleukin-17 receptor IgG1 Fc fusion protein［J］.Arthritis Rheum，2002，46(3):802-805.

［15］Agarwal S，Misra R，Aggarwal A.Interleukin 17 levels are increased in juvenile idiopathic arthritis synovial fluid and induce synovial fibroblasts to produce proinflammatory cytokines and matrix metalloproteinases［J］.J Rheumatol，2008，35(3):515-519.

［16］Sheibanie AF，Khayrullina T，Safadi FF，etal.Prostaglandin E2 exacerbates collagen-induced arthritis in mice through the inflammatory interleukin-23/interleukin-17 axis［J］.Arthritis Rheum，2007，56(8):2608-2619.

［17］周興輝，林連兵.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)液血紅素氧合酶-1水平的變化及臨床意義［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2011，26(10):672-674.

［18］Sylvester J，Liacini A，Li WQ，etal.Interleukin-17 signal transduction pathways implicated in inducing matrix metalloproteinase-3，-13 and aggrecanase-1 genes in articular chondrocytes［J］.Cell Signal，2004，16(4):469-476.

［19］Burrage PS，Mix KS，Brinckerhoff CE.Matrix metalloproteinases:role in arthritis［J］.Front Biosci，2006，11:529-543.

［20］Kokkonen H，S?derstr?m I，Rockl?v J，etal.Upregulation of cytokines and chemokines predates the onset of rheumatoid arthritis［J］.Arthritis Rheum，2010，62(2):383-391.

［21］Papatriantafyllou M.Cytokines:GM-CSF in focus［J］.Nat Rev Immunol，2011，11(6):370-371.