劉慧娜 王瑋

1 儀器與試藥

堿性成纖維生長(zhǎng)因子凍干粉劑(暨南大學(xué)生物研究中心)，堿性成纖維生長(zhǎng)因子試劑盒(上海麥莎生物有限公司購(gòu)買(mǎi)進(jìn)口分裝)，pHS-25型數(shù)顯酸度計(jì)(上海天達(dá)儀器有限公司)，TGL-165型冷凍高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，CL-3型恒溫加熱磁力攪拌器(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)，Bio-Tek-ModeL酶標(biāo)分析儀(美國(guó))，AB135-S電子天平(瑞士梅特勒-托利多)，101型電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)，BD-239LT型低溫冷柜(山東海爾集團(tuán))

2 方法

2.1 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的理化性質(zhì)［1，2］堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)是一種非常不穩(wěn)定的多肽，其凍干粉劑為類(lèi)白色粉末，易溶于水，不溶于二氯甲烷、丙酮、氯仿等有機(jī)溶劑中，弱酸性及堿性環(huán)境、有機(jī)溶劑的存在等都會(huì)導(dǎo)致活性喪失。bFGF的等電點(diǎn)pI=9.6，偏堿性。bFGF有四種形式，以AUG為起始密碼的相對(duì)分子質(zhì)量為18000和以CUG為起始密碼的相對(duì)分子質(zhì)量分別為22000、22500和24000，相對(duì)分子質(zhì)量為18000的bFGF是其活性的主要形式。

2.2 bFGF含量測(cè)定方法的建立

2.2.1 ELISA含量測(cè)定方法 與傳統(tǒng)藥物相比，多肽和蛋白質(zhì)類(lèi)藥物具有種屬特異性、免疫原性和非預(yù)期的多向性活性等特點(diǎn)，給這類(lèi)藥物的分析方法提出了特殊要求。優(yōu)良方法的主要標(biāo)志是:特異性高、靈敏度高、重現(xiàn)性好、回收率高、線性范圍寬?，F(xiàn)在常用的分析方法有:生物鑒定法、放射性同位素標(biāo)記法和免疫學(xué)方法［3］。根據(jù)堿性成纖維生長(zhǎng)因子的理化性質(zhì)及生物學(xué)特性，本研究采用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)［4］測(cè)定藥物含量。

ELISA法的操作步驟:①取出酶標(biāo)板，依照次序?qū)?yīng)加入100 μL的標(biāo)準(zhǔn)品和不同稀釋濃度的待測(cè)樣品于空白微孔中，分別標(biāo)記樣品編號(hào)，陰性對(duì)照孔加入100 μL的重蒸水，并分別做復(fù)孔。然后在標(biāo)準(zhǔn)孔和樣品孔中加入50 μL的酶標(biāo)記溶液混合15 s，于37℃孵育反應(yīng)1 h，甩去酶標(biāo)板中的樣品液，用稀釋后的專(zhuān)用洗滌液清洗5次，每次靜置10～20 s，每孔加入底物顯色劑A和B各50 μL，于37℃下避光孵育反應(yīng)15 min后，再向每孔中加入50 μL終止液，終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上于450nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔的光密度(OD)值。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及線性范圍考察 按照酶聯(lián)免疫試劑盒操作說(shuō)明，取出實(shí)驗(yàn)所需要的微孔板條，在室溫下平衡30 min。依照次序分別精密吸取不同濃度的bFGF標(biāo)準(zhǔn)品溶液各 100 μL，標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為 0、50、100、250、500、1000pg/ml，按2.2.1中操作方法，于450nm處測(cè)定各濃度下藥物的光密度值，記錄結(jié)果見(jiàn)表1。以B/B0%值(B=標(biāo)準(zhǔn)品OD值，B0=標(biāo)準(zhǔn)品0濃度時(shí)的OD值)對(duì)bFGF濃度C進(jìn)行直線回歸，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖1。回歸方程為:

表1 λ=450nm ELISA時(shí)不同濃度bFGF標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)定結(jié)果

由圖1可知，在0～1000pg/ml范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，bFGF的濃度與B/B0%值成定量的反比關(guān)系。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定結(jié)果(450nm)

2.2.3 精密度考察 精密吸取bFGF標(biāo)準(zhǔn)品溶液1000、250、50pg/ml，高中低三個(gè)濃度各100 μL，按照測(cè)定方法操作，加入酶檢測(cè)板微孔中，于450nm處測(cè)定bFGF的光密度，重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 方法精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2中結(jié)果可見(jiàn)，標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度的精密度測(cè)定結(jié)果RSD≤4%，符合藥典要求。

2.2.4 回收率實(shí)驗(yàn) 精密吸取bFGF標(biāo)準(zhǔn)品溶液1000、250、50 pg/ml高中低三個(gè)濃度各100 μL，加入酶檢測(cè)板微孔中，按照2.2.1中的測(cè)定方法操作，于450nm處測(cè)定bFGF的光密度，重復(fù)測(cè)定3次，將結(jié)果代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量及回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 標(biāo)準(zhǔn)品回收率測(cè)定結(jié)果

由表3中結(jié)果可見(jiàn)，高中低濃度樣品的回收率分別為:(100.55±0.90)%、(100.64±1.05)%、(101.16±3.68)%，說(shuō)明ELISA方法的準(zhǔn)確度較高。

3 影響穩(wěn)定性的因素考察［5］

3.1 不同溫度對(duì)bFGF穩(wěn)定性的影響

3.1.1 取bFGF原料藥分裝后的樣品，配制成500、250、100 pg/ml高中低濃度的超純水溶液各三份，將其中一組樣品置于 4 ～5℃冷藏條件下貯藏，分別在 1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、7 d測(cè)定bFGF的光密度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中計(jì)算bFGF的濃度，并進(jìn)行比較。結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4中結(jié)果可得，bFGF水溶液的濃度在7 d內(nèi)沒(méi)有顯著的變化，但第7天的濃度與前5日比略有降低。

3.1.2 將第二組樣品溶液在冷凍條件下(-20℃)貯藏，分別在 1 d、2 d、4 d、7 d、10 d、30 d 測(cè)定 bFGF 的光密度，將數(shù)據(jù)代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品的濃度，并進(jìn)行比較，觀察樣品的穩(wěn)定性。結(jié)果見(jiàn)表5。

由表5中結(jié)果可見(jiàn)，bFGF水溶液的濃度在30 d內(nèi)基本上沒(méi)有發(fā)生變化，說(shuō)明藥物宜于冷凍條件下保存。

3.1.3 將第三組樣品溶液于37.5℃水浴中保存，分別于0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h 測(cè)定 bFGF 的光密度，將數(shù)據(jù)代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品的濃度，并進(jìn)行比較，觀察樣品的穩(wěn)定性。結(jié)果見(jiàn)表6。

由表6結(jié)果可見(jiàn)，bFGF在37.5℃條件下12 h后，其濃度略降低，24 h后，濃度下降明顯，說(shuō)明藥物的活性有部分喪失。

3.2 不同pH對(duì)bFGF穩(wěn)定性的影響 分別取相同體積250pg/ml的三份原料藥儲(chǔ)備液，分別與同體積 pH2.0、pH5.0、pH7.0的Tris-HCL緩沖液混和，制成三種不同pH值條件下的供試品，再分別將這種供試品4℃、15℃、37.5℃下保存，于0 h、0.5 h、1 h、2 h測(cè)定 bFGF的光密度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品的濃度，并進(jìn)行比較。結(jié)果見(jiàn)7。

由表7中結(jié)果可以得出:在溫度為4℃時(shí)，2 h內(nèi)pH值對(duì)bFGF的濃度影響不是特別大，但在pH2時(shí)，1 h后其濃度稍有降低;在溫度為15℃時(shí)，在2 h內(nèi)藥物bFGF的濃度均有所降低，且在pH2時(shí)變化相對(duì)明顯;在溫度為37.5時(shí)，在2 h內(nèi)藥物bFGF的濃度均發(fā)生了比較明顯的變化，特別是在1 h后，變化更為顯著，且pH值越低變化相對(duì)越大。說(shuō)明同樣溫度下，在pH2時(shí)對(duì)藥物bFGF活性的影響比pH5、7時(shí)都要明顯，而溫度在4℃時(shí)活性相對(duì)穩(wěn)定，溫度在15℃和37.5℃時(shí)，1 h后，隨著pH值的降低，藥物bFGF的活性均發(fā)生了不同程度的降低。

3.3 不同攪拌速度bFGF穩(wěn)定性的影響 分別取500pg/ml的bFGF樣品溶液一定量與pH7.6 Tris-HCL緩沖液混合后，置于磁力攪拌器上，分別于880r/min、660r/min、440r/min下，分別于不同時(shí)間0 h，0.5 h，1 h，2 h在450nm處測(cè)定bFGF的光密度，并與不同時(shí)間及不同攪拌速度的測(cè)定值進(jìn)行比較。結(jié)果見(jiàn)表8。

由表8中數(shù)據(jù)可以得出:藥物bFGF在高中低速度攪拌的情況下，在2 h內(nèi)藥物濃度均沒(méi)有顯著性的變化，說(shuō)明藥物bFGF的活性基本上不受攪拌速度的影響，故在2 h內(nèi)高速攪拌時(shí)制備納米粒將不會(huì)影響藥物的活性。

表4 冷藏(4～5℃)保存不同時(shí)間的bFGF濃度

表5 冷凍保存不同時(shí)間的bFGF的濃度

表6 37.5℃時(shí)保存不同時(shí)間的bFGF的濃度

表7 不同溫度下pH對(duì)bFGF影響的濃度

表8 不同轉(zhuǎn)速下不同時(shí)間的bFGF的濃度

4 結(jié)論

4.1 由方法學(xué)考察結(jié)果可以得出:對(duì)0～1000pg/ml范圍內(nèi)藥物的OD值進(jìn)行回歸分析，可得線性關(guān)系良好的直線方程，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:B/B0(%)=-0.0814 c+93.404，相關(guān)系數(shù)r=0.9931，說(shuō)明bFGF的濃度與結(jié)合率(B/B0%)間有定量關(guān)系，且OD值與bFGF濃度之間成良好的反比線性關(guān)系;精密度RSD≤4%，檢測(cè)堿性成纖維生長(zhǎng)因子的靈敏度達(dá)到1.0 pg/ml，說(shuō)明ELISA法具有其快速、準(zhǔn)確、特異性高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，在堿性成纖維生長(zhǎng)因子的質(zhì)量控制方面，ELISA法具有優(yōu)越性、實(shí)用性，便于推廣。ELISA可通過(guò)抗體和抗原的特異性結(jié)合，間接反映其生物活性。因此用ELISA檢測(cè)堿性成纖維生長(zhǎng)因子的生物活性是可行的。

4.2 本研究采用ELISA法，考察了堿性成纖維生長(zhǎng)因子不同溫度、酸堿度及攪拌速度下的穩(wěn)定性，為bFGF在貯藏及其制劑制備過(guò)程中藥物活性的保持，使其更加有效的發(fā)揮藥物作用提供參考。結(jié)果表明:藥物在冷凍條件下保存最穩(wěn)定，至少可以保存1個(gè)月，活性不會(huì)下降;冷藏保存不可超過(guò)7 d，提示該藥制成品宜冷凍保存;在37.5℃水浴中，12 h后藥物的活性略有下降，24 h后下降相對(duì)明顯，故藥物的水溶液在此溫度下保存不宜超過(guò)12 h;在4～15℃下，pH對(duì)藥物活性影響不大;攪拌速度對(duì)藥物的活性也基本上沒(méi)有影響。故4～15℃下，pH2.0～7.0之間以及攪拌速度880r/min在2 h內(nèi)完成制備納米粒不會(huì)破壞堿性成纖維生長(zhǎng)因子。因此，在采用溶劑揮發(fā)法、離子交聯(lián)法及乳化聚合法的制備工藝將該藥制成具有一定載藥量的納米粒制劑是可行的。

［1］ 李勁松，趙涵芳，陳詩(shī)書(shū).bFGF及其受體的研究進(jìn)展．上海免疫學(xué)雜志，2002，22(5):357-360．

［2］ 劉李登，向軍儉.堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)抗體研究進(jìn)展，2009，25(4)379-381．

［3］ 竇曉睿，艾小霞，高熒，等．多肽類(lèi)藥物含量(效價(jià))測(cè)定方法及其應(yīng)用．藥學(xué)進(jìn)展，2011，35(12):536-542．

［4］ 向軍儉，徐曉鵬，王宏，等.堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子單克隆抗體ELISA微量檢測(cè)技術(shù)．中國(guó)免疫學(xué)雜志，2006，22(4):337-241．

［5］ 李國(guó)輝，張玲，謝秋玲，等.兩種類(lèi)型人堿性成纖維生長(zhǎng)因子的體外穩(wěn)定性研究．中國(guó)生物工程雜志，2005，25(4):38-42．