周湘潔，牛東濱，郭志剛，王 亮，趙 琦，杜學(xué)禮，竇躍龍

1中國(guó)人民解放軍總裝備部后勤部航天城門診部;2中國(guó)航天員科研訓(xùn)練中心，北京，100094;3清華大學(xué)化工系，北京 100084

竹節(jié)參(Panax japonicus C.A.Meyer)是五加科人參屬植物，具有滋補(bǔ)強(qiáng)壯、活血化瘀、消腫止痛、健胃、祛痰、解熱的功效，主治跌打損傷，筋骨疼痛，風(fēng)濕痹癥，是我國(guó)的一種名貴中草藥?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，竹節(jié)參具有抗?jié)?、保肝、?zhèn)靜、鎮(zhèn)驚、抗疲勞、損傷保護(hù)、免疫、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤等多種活性［1］。有學(xué)者的研究表明，竹節(jié)參提取物能夠抑制血栓的形成［2］，對(duì)完全性和不完全性腦缺血、胃缺血、心肌缺血以及再灌注損傷動(dòng)物模型具有保護(hù)作用［3-6］;竹節(jié)參皂苷能夠抑制腦及心肌缺血缺氧的損傷，減輕組織水腫，可能與其改善機(jī)體自由基代謝、干預(yù)缺血后的細(xì)胞凋亡等有關(guān)［7-10］。但有關(guān)竹節(jié)參總皂苷在抗低壓缺氧方面的研究尚未見報(bào)道。

在載人航天在軌飛行中，當(dāng)航天員出艙活動(dòng)往返于軌道艙和氣閘艙之間時(shí)，面臨的風(fēng)險(xiǎn)之一就是急性低壓缺氧，高原作業(yè)以及疾病發(fā)生過程中也會(huì)經(jīng)常發(fā)生缺氧狀況。本實(shí)驗(yàn)擬將大鼠暴露于模擬海拔8000 m低壓缺氧艙內(nèi)8 h，建立動(dòng)物急性低壓缺氧模型，以紅景天提取物為中藥陽(yáng)性對(duì)照，尼莫地平為西藥陽(yáng)性對(duì)照，竹節(jié)參總皂苷為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過光鏡對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的心腦組織細(xì)胞變化進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，以研究急性低壓缺氧對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的損傷和藥物的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用Wistar大鼠，雄性，4月齡，體重195～212 g。由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(京)2006-0009。竹節(jié)參總皂苷，由清華大學(xué)化工系生化所利用索式提取以及制備色譜法從竹節(jié)參培養(yǎng)細(xì)胞中提取分離獲得。尼莫地平注射液:4 mg∶20 mL，(批號(hào):0503101，山東亞寶藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn));紅景天提取物(由“八一”體工隊(duì)藥物研究所提供)。動(dòng)物加壓減壓實(shí)驗(yàn)艙:蕪湖潛水設(shè)備廠生產(chǎn)。

1.2 動(dòng)物分組設(shè)計(jì)

選取Wistar大鼠60只，隨機(jī)分為5組，每組12只。即①竹節(jié)參總皂苷組，②紅景天提取物組，③尼莫地平組，④陰性對(duì)照組(低壓處理對(duì)照組)，⑤空白對(duì)照組(常壓處理對(duì)照組)。

1.3 給藥方法

竹節(jié)參總皂苷與紅景天提取物分別制成溶液。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用分籠飼養(yǎng)，每籠6只，自由采食。適應(yīng)飼養(yǎng)4 d后，①、②、③組每日清晨灌胃給藥，劑量為:①組為相當(dāng)于竹節(jié)參總皂苷100 mg/kg，②組為相當(dāng)于紅景天提取物量100 mg/kg，③組為相當(dāng)于尼莫地平1 mg/kg，④、⑤組灌胃給與等量生理鹽水。動(dòng)物連續(xù)灌胃給藥14 d。

1.4 大鼠急性低壓缺氧模型的制備方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組灌胃給藥14 d后，于末次給藥30 min后開始進(jìn)行急性低壓缺氧實(shí)驗(yàn)，將動(dòng)物置于動(dòng)物加壓減壓實(shí)驗(yàn)艙內(nèi)(艙容積為1 m3)，關(guān)閉艙門，調(diào)整艙內(nèi)壓力漸減，在10 min左右將艙內(nèi)壓力減至0.068 MPa(相當(dāng)于以10 m/s上升至海拔8000 m)，維持此壓力8 h，制備大鼠急性低壓缺氧模型，艙內(nèi)溫度保持為恒溫16℃，完成缺氧時(shí)間后將艙內(nèi)壓力升至正常大氣壓，速度仍為10 m/s;空白對(duì)照組置于實(shí)驗(yàn)艙附近，于正常大氣壓下滯留8 h。動(dòng)物出艙后30 s內(nèi)迅速斷頭、取血、分離腦組織，進(jìn)行觀察、保存和檢測(cè)。

1.5 組織切片樣本處理

每組隨機(jī)取3只大鼠，切除右側(cè)半腦，置于4℃磷酸鹽緩沖液(0.01M PBS，pH=7.3)中洗去血液，用小塊紗布包裹，鉛筆標(biāo)記，置于10%的福爾馬林溶液中，同樣方法取心肌組織并保存。

1.6 腦組織含水量測(cè)定

大鼠斷頭取腦后，用濾紙吸去腦表面的水分，每組取9只大鼠的右側(cè)半腦，分析天平稱濕重(w)，用鋁箔紙分別包裹標(biāo)記，置110℃烘箱內(nèi)烘干24 h至恒重(D)，用干濕重法(H2O)%=〔(W-D)/W ×100%〕計(jì)算每份腦組織水含量，結(jié)果用%表示。并用鄧肯氏測(cè)驗(yàn)法對(duì)不同處理的數(shù)據(jù)進(jìn)行了差異顯著性分析。

1.7 細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察

將心肌、腦組織分別置于4℃磷酸鹽緩沖液(0.01M PBS，pH=7.3)中洗去血液，用 10% 福爾馬林固定。通過脫水、透明處理、浸蠟、包埋、切片、用蘇木素染色液染色、水洗、伊紅復(fù)染、脫水透明和樹脂封固等步驟，再置于光學(xué)顯微鏡下觀察心、腦組織細(xì)胞形態(tài)變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 竹節(jié)參總皂苷對(duì)Wistar大鼠腦組織含水量的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，與空白對(duì)照組相比，各低壓缺氧模型組Wistar大鼠的腦組織含水量均顯著升高。其中竹節(jié)參總皂苷組、紅景天提取物組和尼莫地平組等三個(gè)給藥組的腦組織含水量沒有顯著性差異，但是均顯著低于陰性對(duì)照組。表明竹節(jié)參總皂苷、紅景天提取物和尼莫地平給藥的Wistar大鼠，在低壓缺氧環(huán)境下均具有抑制腦組織水腫的作用。因此可以證明竹節(jié)參總皂苷具有與紅景天提取物相同的抗腦組織水腫的效果，該結(jié)果與劉家蘭［4］等的實(shí)驗(yàn)結(jié)論基本相同。至于竹節(jié)參總皂苷抑制腦組織水腫的作用機(jī)理，可能與竹節(jié)參總皂苷具有抗氧化、抑制氧自由基生成［6，8］，抑制了細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，改善了細(xì)胞膜的鈣離子釋放等作用相關(guān)。具體作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

表1 竹節(jié)參總皂苷對(duì)急性低壓缺氧大鼠腦組織含水量的影響Table 1 Effect of PJTS on brain tissue water content of rat in acute hypobaric hypoxia

2.2 竹節(jié)參總皂苷對(duì)急性低壓缺氧Wistar大鼠腦組織和細(xì)胞損傷的抑制效果

從腦組織外觀和顯微觀察(圖1)發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組Wistar大鼠的腦組織形態(tài)顯示腦膜血管無(wú)擴(kuò)張，腦組織無(wú)腫脹;腦組織切片顯示，腦各部位結(jié)構(gòu)及層次明顯，形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰完整，腦實(shí)質(zhì)中細(xì)胞核仁清晰，神經(jīng)纖維細(xì)胞縱橫交錯(cuò)，排列致密(圖1a)。而陰性對(duì)照組的形態(tài)顯示，腦膜血管中度擴(kuò)張，腦組織細(xì)胞極度腫脹;腦組織切片顯示，腦各部位結(jié)構(gòu)及層次紊亂，細(xì)胞水腫明顯，胞漿變寬，淡染，排列紊亂，間質(zhì)疏松水腫(圖1b)。竹節(jié)參總皂苷給藥組的形態(tài)顯示腦膜血管輕度擴(kuò)張，腦組織輕度腫脹;腦組織切片顯示，腦各部位結(jié)構(gòu)及層次較陰性對(duì)照組清楚，腦組織結(jié)構(gòu)變化不大，細(xì)胞水腫不明顯，胞漿減少，極性存在，間質(zhì)輕微疏松，有少量細(xì)胞出現(xiàn)腫脹，胞漿有空泡化現(xiàn)象(圖1c)。紅景天提取物給藥組的形態(tài)顯示腦膜血管輕度擴(kuò)張，腦組織輕度腫脹;腦組織切片顯示，細(xì)胞有輕度水腫，細(xì)胞腫脹，間質(zhì)疏松(圖1d)。尼莫地平給藥組的形態(tài)顯示腦膜血管中度擴(kuò)張，腦組織中度腫脹;腦組織切片顯示，腦各部位結(jié)構(gòu)及層次較陰性對(duì)照組清楚，細(xì)胞水腫較明顯，部分細(xì)胞變形，胞漿減少，胞漿空泡化，間質(zhì)疏松(圖1e)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在急性低壓缺氧環(huán)境下，Wistar大鼠的腦組織和細(xì)胞會(huì)受到極大損傷。竹節(jié)參總皂苷、紅景天提取物和尼莫地平給藥組的Wistar大鼠雖然在急性低壓缺氧環(huán)境下，其腦細(xì)胞同樣受到傷害，但是與陰性對(duì)照組相比其損傷癥狀明顯減輕。特別是竹節(jié)參總皂苷給藥組的腦細(xì)胞雖然有輕度水腫，但是基本保持清晰完整。表明竹節(jié)參總皂苷在急性低壓缺氧環(huán)境下可以保護(hù)Wistar大鼠腦細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能的完整性。

圖1 竹節(jié)參總皂苷對(duì)急性低壓缺氧大鼠腦組織和細(xì)胞形狀的影響(光鏡HE染色，×400)Fig.1 Effect of PJTS on brain tissue cell morphology of rat in acute hypobaric hypoxia(microscopy with HE staining，×400)

2.3 竹節(jié)參總皂苷對(duì)急性低壓缺氧Wistar大鼠心肌組織和細(xì)胞損傷的抑制效果

從心肌組織外觀和顯微觀察(圖2)發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組的形態(tài)顯示W(wǎng)istar大鼠的心肌組織無(wú)腫脹，無(wú)異常變化;組織切片顯示，心肌各部位結(jié)構(gòu)及層次清楚，形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰完整，心肌纖維細(xì)胞縱橫交錯(cuò)，排列有致(圖2a)。而陰性對(duì)照組的形態(tài)顯示心肌膜血管中度擴(kuò)張，組織腫脹;組織切片顯示心肌各部位結(jié)構(gòu)及層次紊亂，細(xì)胞水腫明顯，細(xì)胞變形、胞漿變寬，淡染，排列紊亂，間質(zhì)疏松水腫(圖2b)。竹節(jié)參總皂苷給藥組的形態(tài)顯示心肌膜血管輕度擴(kuò)張，組織輕度腫脹;組織切片顯示細(xì)胞輕度水腫，心肌組織結(jié)構(gòu)變化不大，有少量細(xì)胞腫脹，間質(zhì)輕微疏松，胞漿有空泡化現(xiàn)象(圖2c)。紅景天提取物給藥組的形態(tài)顯示心肌膜血管輕度擴(kuò)張，組織輕度腫脹;組織切片顯示細(xì)胞有輕度水腫，腫脹，胞漿減少，極性存在，間質(zhì)輕微疏松(圖2d)。尼莫地平給藥組的外觀顯示大鼠心肌膜血管輕度擴(kuò)張，組織腫脹;組織切片顯示細(xì)胞水腫較明顯，細(xì)胞腫脹，部分細(xì)胞胞漿變寬，排列紊亂(圖2e)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在急性低壓缺氧環(huán)境下，Wistar大鼠的心肌組織和細(xì)胞會(huì)受到極大損傷。竹節(jié)參總皂苷、紅景天提取物和尼莫地平給藥組的Wistar大鼠雖然在急性低壓缺氧環(huán)境下，其心肌細(xì)胞同樣受到一定傷害，但是與陰性對(duì)照組相比其損傷程度明顯減輕。特別是竹節(jié)參總皂苷給藥的心肌細(xì)胞雖然有輕度水腫，但是基本保持清晰完整。表明竹節(jié)參總皂苷在急性低壓缺氧環(huán)境下，可以有效保護(hù)Wistar大鼠的心肌組織和細(xì)胞的結(jié)構(gòu)以及功能的完整性。

總之，從組織和細(xì)胞的形態(tài)變化可以明顯看到竹節(jié)參總皂苷在急性低壓缺氧環(huán)境下，對(duì)于Wistar大鼠的腦和心肌細(xì)胞均具有良好的保護(hù)作用。至于其作用機(jī)理可能與竹節(jié)參總皂苷具有抗氧化、清除氧自由基，維護(hù)細(xì)胞膜通透性，抑制腦和心肌缺血損傷密切相關(guān)［3-10］，但是由于竹節(jié)參總皂苷中含有竹節(jié)參皂苷、人參皂苷和三七皂苷等，其保護(hù)效果不是某單一物質(zhì)在起作用，而是多種皂苷類化合物綜合作用的結(jié)果。如果要徹底解析其作用機(jī)制，還需要進(jìn)一步深入探討。

圖2 竹節(jié)參總皂苷對(duì)急性低壓缺氧大鼠心肌組織細(xì)胞形態(tài)的影響(光鏡HE染色×400)Fig.2 Effect of PJTS on myocardial tissue cell morphology of rat in acute hypobaric hypoxia(microscopy with HE staining，× 400)

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