張卓偉，柳 潔，張華屏

糖尿病血管并發(fā)癥是糖尿病患者致死的主要原因之一，而內(nèi)皮細(xì)胞的損傷是血管病變的前提。同型半胱氨酸（homocysteine，HCY）作為心血管疾病的危險(xiǎn)因素，與糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展有一定關(guān)系。但其具體發(fā)病機(jī)制尚未闡明。研究顯示可能與高血壓、血流流變學(xué)、血脂紊亂、高血糖等因素有關(guān)，而有關(guān)蛋白質(zhì)、氨基酸代謝異常在糖尿病血管并發(fā)癥中作用的研究非常匱乏[1]。因此本研究觀察HCY對(duì)體外高糖培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（HUVEC）ECV－304活性氧的釋放和細(xì)胞間黏附分子－1（ICAM－1）mRNA表達(dá)的影響，為臨床早期干預(yù)高同型半胱氨酸血癥提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株購自南京凱基生物合成有限公司；RPMI1640購自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青生物有限公司。D－L同型半胱氨酸、胰蛋白酶為Sigma公司產(chǎn)品；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒購自南京建成生物工程研究所。PCR試劑盒購于大連寶生物公司，引物由上海生物公司合成。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或進(jìn)口分裝。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組 人血管內(nèi)皮細(xì)胞株用RPMI1640培養(yǎng)，用前加10%滅活胎牛血清。細(xì)胞置于5%的CO2培養(yǎng)箱中37℃孵育培養(yǎng)，0.25%的胰酶消化傳代。分組情況，正常對(duì)照組：含RPMI1640培養(yǎng)液。高糖組（HG組）：培養(yǎng)液中含終濃度25mmol／L葡萄糖。HCY組：培養(yǎng)液中含終濃度5 mmol／L HCY。高糖＋HCY組：培養(yǎng)液中含葡萄糖25mmol／L和 HCY 5mmol／L。

1.2.2 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)

1.2.2.1 上清液收集及檢測(cè) ECV－304以每孔1×106接種到6孔板上，當(dāng)生長(zhǎng)至85%融合時(shí)收集上清液。按上述實(shí)驗(yàn)分組方法，在作用12h、24h、48h之后分別收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，離心以去除細(xì)胞碎片，－20℃保存?zhèn)溆?，用硫代巴比妥酸法檢測(cè)MDA，黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)SOD。

1.2.2.2 RT－PCR檢測(cè)ICAM－1mRNA的表達(dá)水平 將ECV－304細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，隨機(jī)分組和處理同上。處理12 h、24h、48h后分別收集各組細(xì)胞，Trizol法提取RNA，瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定RNA的完整性。提取的RNA用紫外分光光度儀檢測(cè)260nm、280nm吸光度并求出A260／A280，結(jié)果是所提RNA值在1.8～2.0，說明純度符合要求。進(jìn)行cDNA合成，反轉(zhuǎn)錄后的cDNA作為PCR模板。PCR擴(kuò)增引物序列。ICAM－1 長(zhǎng) 度 為 555bp，上游引物：5′－CAGTGACCATCTACAGCTTTCCGG－3′，下游引物：5′－GCTGCTACCACAGTGATGATGACAA－3′；內(nèi)參照 GAPDH 上游引物：5′－ACCACAGTCCATGCCATCAC－3′，下游引物：5′－TCCACCACCCTGTTGCTGTA－3′。PCR反應(yīng)條件為：94℃變性1min，56℃退火1min，72℃延伸2min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增完畢后取PCR產(chǎn)物10μL做1.5%的瓊脂凝膠電泳，凝膠圖像分析儀分析，根據(jù)目的基因與內(nèi)參基因電泳條帶光密度的比值，進(jìn)行ICAM－1mRNA表達(dá)水平的半定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，每次實(shí)驗(yàn)至少有3個(gè)重復(fù)值。所有數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用多因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 光鏡下細(xì)胞形態(tài)的觀察 正常人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞形狀為棱形，單層生長(zhǎng)，呈典型的鵝卵石樣鑲嵌排列。5mmol／L HCY作用24h后，可見細(xì)胞普遍收縮，間隙增大，細(xì)胞變小變圓，并有片狀細(xì)胞脫失區(qū)。

2.2 細(xì)胞上清液中SOD活力的測(cè)定（見表1） HCY組、HG組、HG＋HCY組在各時(shí)間點(diǎn)SOD活力均低于正常對(duì)照組（P＜0.01），且HG＋HCY組較HG組、HCY組降低的更明顯（P＜0.01）。呈時(shí)間依賴性關(guān)系。

表1 ECV304細(xì)胞上清液SOD活力變化（±s） U／mL

表1 ECV304細(xì)胞上清液SOD活力變化（±s） U／mL

組別 n 12h 24h 48h正常對(duì)照組 3 24.602±0.446 24.026±0.197 24.038±0.066 HG組 3 22.584±1.3461） 20.145±2.4551） 16.872±1.6961）HCY組 3 21.216±2.3741） 18.665±1.3221） 14.047±6.7521）HG＋HCY組3 16.805±1.4411）2） 13.957±5.2241）2） 10.674±9.3981）2）與正常對(duì)照組相比，1）P＜0.01；與HG組HCY組相比，2）P＜0.01

2.3 細(xì)胞上清液 MDA水平的測(cè)定（見表2） HG組、HCY組、HG＋HCY組各時(shí)間點(diǎn)MDA水平均高于正常對(duì)照組（P＜0.01），且HG＋HCY組較HG組、HCY組升高的更明顯（P＜0.01）。隨時(shí)間延長(zhǎng)，MDA水平逐漸升高（P＜0.01）。呈時(shí)間依賴性關(guān)系。

表2 ECV304細(xì)胞上清液MDA水平變化（±s） nmol／mL

表2 ECV304細(xì)胞上清液MDA水平變化（±s） nmol／mL

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2.4 測(cè)定ICAM－1mRNA 的表達(dá)（見圖1、表3） ICAM－1 mRNA擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為555bp，GAPDH擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為452bp，對(duì)照組ECV304ICAM－1mRNA呈低表達(dá)。HG組、HCY組、HG＋HCY組ICAM－1mRNA表達(dá)顯著高于同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組（P＜0.01），HG＋HCY組ICAM－1mRNA表達(dá)較HG組、HCY組增加的更明顯，具有時(shí)間依賴性。

表3 HCY對(duì)ECV－304細(xì)胞ICAM－1mRNA表達(dá)的影響（±s）

表3 HCY對(duì)ECV－304細(xì)胞ICAM－1mRNA表達(dá)的影響（±s）

組別 n 12h 24h 48h正常對(duì)照組 3 0.63±0.04 0.62±0.03 0.65±0.04 HG組 3 0.81±0.031） 0.92±0.011） 0.98±0.011）HCY組 3 0.90±0.021） 0.98±0.011） 1.07±0.021）HG＋HCY組 3 1.05±0.051）2） 1.19±0.041）2） 1.32±0.051）2）與正常對(duì)照組相比，1）P＜0.01；與HG組、HCY組相比，2）P＜0.01

圖1 HCY對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM－1mRNA表達(dá)的影響

3 討 論

同型半胱氨酸是一種血管損傷性氨基酸[2－4]，是蛋氨酸代謝的中間產(chǎn)物。它的生理作用是維持體內(nèi)含硫氨基酸的平衡。目前研究表明糖尿病患者HCY水平的增高是血管病變的重要危險(xiǎn)因素。高同型半胱氨酸血癥作為心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素已經(jīng)得到普遍認(rèn)同，在最近的一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，糖尿病與非糖尿病人群的比較，高同型半胱氨酸血癥是獨(dú)立于其他危險(xiǎn)因素的與預(yù)期5年死亡率相關(guān)的危險(xiǎn)因素，而且似乎是最強(qiáng)的危險(xiǎn)因素[5]。大量研究發(fā)現(xiàn)[6]血漿同型半胱氨酸水平升高可加速動(dòng)脈粥樣硬化，并出現(xiàn)動(dòng)脈和靜脈血栓形成，從而引起心腦血管疾病及周圍血管疾病。

HCY致血管病變的機(jī)制不是十分清楚，國(guó)內(nèi)外對(duì)大血管病變的研究認(rèn)為，HCY的作用可能與血小板激活、平滑肌增生、內(nèi)皮細(xì)胞功能失常、脂蛋白氧化和血黏滯度增加有關(guān)[7]。內(nèi)皮損傷是導(dǎo)致糖尿病血管病變的重要因素。最近，有研究顯示HCY作用于培養(yǎng)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過活性氧（ROS）的大量釋放，刺激NF－κB的活化，從而使ICAM－1mRNA的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)上調(diào)及增強(qiáng)單核細(xì)胞的黏附和聚集[8]。適量的ROS是維持細(xì)胞正常生長(zhǎng)和機(jī)體抗感染必需的，但過量的ROS可以對(duì)機(jī)體造成病理生理損害。另一項(xiàng)研究顯示，HCY可呈時(shí)間和劑量依賴性上調(diào)單核細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，0.1mmol／L HCY可使單核細(xì)胞的黏附增加5倍，同時(shí)血管細(xì)胞黏附分子－1（VCAM－1）mRNA的表達(dá)增加5倍[9]。為進(jìn)一步探討高 HCY和高血糖兩種危險(xiǎn)因子共存的致病危險(xiǎn)性，本研究觀察高糖環(huán)境下HCY對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響與ICAM－1表達(dá)的關(guān)系，結(jié)果顯示HCY組血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM－1mRNA表達(dá)水平是增高的，而且HG＋HCY組較HCY組和HG組增高的更明顯，提示ICAM－1可能參與HCY對(duì)糖尿病血管病變的加重作用，同時(shí)HCY處理培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，血紅素加氧酶和谷胱甘肽過氧化酶的表達(dá)和活性均減弱，提示HCY可抑制細(xì)胞抗氧化能力[10]。HCY也可通過抑制細(xì)胞抗氧化酶的活性[11]，減少活性氧的清除，導(dǎo)致活性氧在細(xì)胞內(nèi)和線粒體內(nèi)聚集[12]。活性氧又通過PKC及絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）使轉(zhuǎn)錄因子NF－κB活化，啟動(dòng)包括ICAM－1啟動(dòng)子在內(nèi)的多種細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子的轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致一系列靶基因的表達(dá)，最終導(dǎo)致細(xì)胞功能的改變，這些細(xì)胞因子組成了復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管病變的發(fā)生和發(fā)展。近年來有學(xué)者提出蛋白質(zhì)同型半胱氨酸化（HcyT）在其致病中可能發(fā)揮重要作用[13]，而大量研究HcyT可能使血管內(nèi)皮細(xì)胞呈劑量依賴性發(fā)生凋亡[14]。發(fā)現(xiàn)上述結(jié)論與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致，HG＋HCY組刺激能使內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，使SOD下降，MDA升高，ICAM－1mRNA表達(dá)上調(diào)，且HG＋HCY組較HCY組和HG組改變的更顯著，并具有時(shí)間依賴性，提示HCY可能通過氧化應(yīng)激機(jī)制上調(diào)ICAM－1的表達(dá)從而損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞。

黏附分子（adhesionmolecules）是由細(xì)胞產(chǎn)生、存在于細(xì)胞表面、介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間或細(xì)胞與基質(zhì)間相互接觸和結(jié)合的一類分子。黏附分子大多為糖蛋白，少數(shù)為糖脂，分布于細(xì)胞表面或細(xì)胞外基質(zhì)中，以配體一受體相對(duì)應(yīng)的形式發(fā)揮作用，導(dǎo)致細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與基質(zhì)間或細(xì)胞－基質(zhì)－細(xì)胞之間的黏附，參與細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與活化、細(xì)胞的伸展和移動(dòng)、細(xì)胞的生長(zhǎng)及分化、炎癥、血栓形成、腫瘤轉(zhuǎn)移、創(chuàng)傷愈合等一系列重要生理和病理過程。ICAM－1是最重要的黏附分子之一，在體內(nèi)分布較廣泛，主要分布在白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞等表面，但在血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)最強(qiáng)，在正常情況下僅有少量表達(dá)，但受缺氧、炎性細(xì)胞因子、內(nèi)毒素等刺激后，內(nèi)皮細(xì)胞ICAM－1表達(dá)增加，其增高是內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞損害與激活的標(biāo)志[15]。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)5mmol／L HCY刺激能使內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，SOD下降，MDA升高，同時(shí)氧化應(yīng)激又能引起ICAM－1的表達(dá)上調(diào)，產(chǎn)生大量的黏附分子，高表達(dá)的黏附分子通過增強(qiáng)血流細(xì)胞的黏附，造成相應(yīng)微血管的阻塞和內(nèi)皮細(xì)胞損傷，從而引起糖尿病血管病變的發(fā)生，近來大量臨床試驗(yàn)證明HCY在患者體內(nèi)的濃度高低可以反映其血管損傷的程度和心血管事件發(fā)生的概率高低[16]，此外還有大量研究發(fā)現(xiàn)任何導(dǎo)致血中葉酸、維生素B12或維生素B6濃度降低的營(yíng)養(yǎng)缺乏均會(huì)增加高HCY，而適當(dāng)補(bǔ)充維生素B族或葉酸可降低血漿中HCY水平。因此早期干預(yù)高同型半胱氨酸血癥對(duì)糖尿病患者具有重要意義。

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