吳愛明，翟建英，張冬梅，婁利霞，朱海燕，趙明鏡，王碩仁

心肌梗死（MI）是威脅人類健康的主要疾病之一[1]，在我國發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高趨勢[2]。雖然隨著MI后再灌注治療的普及，患者早期死亡率大幅降低[3]，但是幸存的MI患者仍具有發(fā)生致死性心律失常的潛在風(fēng)險(xiǎn)[4]。這與基因的改變和調(diào)控密不可分。因此，有必要從基因水平研究MI后心律失常的發(fā)生機(jī)制，以進(jìn)一步降低MI患者的猝死率。本研究制作MI大鼠模型，進(jìn)行了左心室心肌組織的全基因組表達(dá)譜芯片檢測和分析，并采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real－time PCR）方法驗(yàn)證了心肌細(xì)胞間縫隙連接通路相關(guān)的3條基因，旨在為進(jìn)一步從基因水平認(rèn)識MI后心律失常發(fā)生的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠，平均體重220g～250g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證編號：SCXK（京）2002－0003。

1.2 主要儀器 RSP1002型呼吸機(jī)（美國Kent公司），心電示波儀（上海醫(yī)學(xué)電子儀器廠），雜交爐（美國Agilent公司），掃描儀（美國 Agilent公司），分光光度計(jì)（美國Nanodrop公司），Realtime PCR儀（美國Stratagene公司）。

1.3 主要試劑 RNA提取試劑盒（美國Promega公司），RT試劑盒（美國Promega公司），SYBER Green染料（美國ABI公司）。Agilent大鼠全基因組表達(dá)譜芯片（生物芯片上海國家工程研究中心）。

1.4 動(dòng)物模型制備與分組方法 大鼠隨機(jī)分為模型組和假手術(shù)組，參照文獻(xiàn)[5]制作 MI大鼠模型，用戊巴比妥鈉（50mg／kg）麻醉，固定備皮，氣管插管，連呼吸機(jī)和心電圖儀。在左胸第三、四肋間開胸約1.5cm，用眼科彎鑷輕提左心耳，在動(dòng)脈圓錐與左心耳之間下約1mm處用5／0手術(shù)線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，迅速關(guān)胸縫合。心電圖Ⅱ?qū)?lián)顯示ST段顯著抬高表示結(jié)扎成功。假手術(shù)組只穿線，不結(jié)扎。術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)1個(gè)月取材。

1.5 心肌組織的基因芯片檢測和生物學(xué)信息分析方法 由生物芯片上海國家工程研究中心完成。首先提取心肌組織樣本的總RNA，質(zhì)檢合格后進(jìn)行總RNA純化，cDNA合成，cRNA合成，cRNA純化，cRNA單熒光染料（Cy3）標(biāo)記，芯片雜交、洗滌、掃描，歸一化處理等一系列步驟，得到基因芯片檢測結(jié)果。然后對模型組和假手術(shù)組的芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行差異基因分析，根據(jù)基因在兩個(gè)分組中幾何平均數(shù)的比值倍數(shù)決定差異基因的變化方向，比值大于1的基因?yàn)樯险{(diào)基因，小于1的是下調(diào)基因。用Fold Change值表示兩組數(shù)據(jù)均一化以后的信號值的差異倍數(shù)。差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)為Fold Change值≥2或≤0.5。在此基礎(chǔ)上利用京都基因與基因組百科全書（The Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）細(xì)胞通路（pathway）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行差異基因的pathway注釋，對差異基因富集的pathway進(jìn)行歸類，初步分析MI后pathway的變化。

1.6 心肌組織縫隙連接蛋白43（Cx43）、蛋白激酶C（PKC）、酪蛋白激酶1（CK1）的mRNA檢測方法 登陸GenBank檢索基因序列，用Primer Premier 5軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。Cx43上游引物：5′－TTCATGCTGGTGGTGTCC－3′；下游引物：5′－AGTGGTGGCGTGGTAAGG－3′。CK1 上游引物：5′－TACCGCCAACCGACTCCGAAGT－3′ ；下游引物：5′－GCGCACCTCTGTGGAGTCTCAT－3′。PKC 上游引物：5′－GCTTCAACATCGACATGCCTCACC－3′；下游引物：5′－ACATTCATGCCGCAGTCTTCACACT－3′。內(nèi) 參 基 因 β－Actin 上游引物：5′－AGATCCTGACCGAGCGTGGC－3′；下游引物：5′－CCAGGGAGGAAGAGGATGCG－3′。提取左心室梗死邊緣區(qū)心肌組織總RNA，M－MLV逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)成cDNA，加入SYBR Green PCR Master Mix組成251反應(yīng)體系，每個(gè)樣本做3個(gè)平行管，進(jìn)行Real－time PCR檢測。擴(kuò)增條件均為：95℃10min變性后；95℃30s，55℃30s，72℃20s，共40個(gè)循環(huán)。以β－Actin作為內(nèi)參，將所得Ct值按照2（－ΔΔct）的方法計(jì)算mRNA的相對表達(dá)量，以差異倍數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 RNA純度和完整性檢測結(jié)果（見表1） 總RNA經(jīng)分光光度計(jì)檢測，OD260nm／OD280nm，比值介于1.8～2.1；經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，28S、18S兩條帶清晰可見，且無拖尾現(xiàn)象，提示完整性良好，可以進(jìn)行基因表達(dá)譜芯片檢測。

表1 RNA抽提檢測結(jié)果

2.2 基因芯片檢測和生物學(xué)信息分析結(jié)果 Agilent大鼠全基因組表達(dá)譜芯片采用Cy3單色熒光標(biāo)記，芯片涵蓋了41 012個(gè)大鼠基因。按照差異表達(dá)基因篩選標(biāo)準(zhǔn)，與假手術(shù)組比較，模型組共篩選出上調(diào)表達(dá)的基因3 136條，下調(diào)表達(dá)的基因2 222條。pathway富集度分析顯示，這些差異基因共涉及了130個(gè)pathway。對檢索到的pathway進(jìn)行初步歸類，主要涉及了糖、脂、核酸、氨基酸、能量等新陳代謝pathway；基因轉(zhuǎn)錄、蛋白水解、修飾等遺傳信息處理pathway；膜轉(zhuǎn)運(yùn)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、信號分子等環(huán)境信息處理pathway；還有運(yùn)輸分解、細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、生長、死亡以及細(xì)胞間通訊等細(xì)胞過程pathway。其中與MI后心律失常發(fā)生關(guān)系比較密切的是細(xì)胞通信pathway，并且其重要分支縫隙連接pathway中的關(guān)鍵蛋白Cx43及其上游激酶CK1和PKC的基因表達(dá)出現(xiàn)了顯著的下調(diào)和上調(diào)。

2.3 MI大鼠心肌組織Cx43、PKC、CK1mRNA檢測結(jié)果 采用Real－time PCR檢測相關(guān)基因表達(dá)，與假手術(shù)組比較，模型組Cx43和CK1mRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），PKC mRNA表達(dá)顯著增加（P＜0.05）。詳見表2。

表2 MI大鼠心肌組織Cx43、CK1、PKC mRNA表達(dá)的比較（±s）

表2 MI大鼠心肌組織Cx43、CK1、PKC mRNA表達(dá)的比較（±s）

組別 n Cx43mRNA CK1mRNA PKC mRNA假手術(shù)組7 1.02±0.21 1.00±0.07 1.03±0.23模型組 6 0.54±0.35 0.78±0.16 1.35±0.23 P＜0.05 ＜0.01 ＜0.05

2.4 MI大鼠心肌組織Cx43與CK1、PKC mRNA表達(dá)的相關(guān)分析結(jié)果 經(jīng)Pearson相關(guān)分析，MI大鼠心肌組織Cx43mRNA表達(dá)與CK1mRNA呈顯著正相關(guān)（P＜0.01），與PKC mRNA呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。詳見表3。

表3 MI大鼠心肌組織Cx43與CK1、PKC mRNA表達(dá)的相關(guān)分析

3 討 論

基因芯片技術(shù)是指通過微陣（Microarray）技術(shù)將高密度的DNA片段附著在固相表面，以同位素或熒光標(biāo)記的DNA探針，借助堿基互補(bǔ)雜交原理，進(jìn)行大量基因表達(dá)測試，具有高通量的特點(diǎn)[6]。基因芯片實(shí)驗(yàn)技術(shù)包括基因表達(dá)測試——生物信息學(xué)分析——驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)三部分，本研究嚴(yán)格遵循了這些技術(shù)要求?；虮磉_(dá)測試采用了比較成熟的Agilent大鼠全基因組表達(dá)譜芯片，然后借助KEGG pathway數(shù)據(jù)庫對芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行了初步的生物信息學(xué)的分析，最后用Real－time PCR技術(shù)進(jìn)行了感興趣基因的驗(yàn)證。

本研究結(jié)果提示，MI后心臟基因表達(dá)發(fā)生了復(fù)雜的變化，出現(xiàn)了上千條基因的上調(diào)和下調(diào)，初步歸類這些差異基因發(fā)現(xiàn)涉及的pathway主要包括：糖、脂、氨基酸、能量等眾多代謝過程，并且基因轉(zhuǎn)錄、蛋白水解、修飾、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等遺傳信息和環(huán)境信息的處理也都表現(xiàn)出一定差異。此外，在細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、生長、死亡和細(xì)胞間通訊等細(xì)胞過程的pathway同樣出現(xiàn)了基因異常表達(dá)。其中與MI后心律失常發(fā)生關(guān)系比較密切的是細(xì)胞通信pathway。細(xì)胞通信是細(xì)胞間精確和高效的發(fā)送與接收信息的通訊機(jī)制。細(xì)胞通信pathway包括多種方式，就心室肌組織而言，縫隙連接pathway是其重要分支，由Cx43構(gòu)成的心肌縫隙連接對心電活動(dòng)影響巨大，它是維持心臟電活動(dòng)協(xié)調(diào)性和同步性的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)之一[7]。Cx43的異常將導(dǎo)致心室肌細(xì)胞電活動(dòng)的整體性異常，從而使傳導(dǎo)的速度和傳導(dǎo)的各向異性發(fā)生改變，引起折返和傳導(dǎo)阻滯[8，9]，最終誘發(fā)惡性心律失常而危及患者生命。在縫隙連接pathway中Cx43受多種因素調(diào)節(jié)，本研究的基因芯片和熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果均表明，MI后Cx43的上游調(diào)節(jié)因子中CK1和PKC mRNA的異常表達(dá)明顯，可能共同導(dǎo)致了Cx43mRNA表達(dá)的下調(diào)。相關(guān)分析證實(shí)了這一推測，CK 1對Cx 4 3的基因表達(dá)有正調(diào)節(jié)作用（r＝0.765，P＜0.01），PKC對Cx43的基因表達(dá)有負(fù)面影響（r＝－0.645，P＜0.05）。CK1與Cx43的正相關(guān)關(guān)系可能與CK1促進(jìn)縫隙連接通道的裝配有關(guān)[10]。而PKC則是通過調(diào)節(jié)Cx43的磷酸化而下調(diào)了Cx43介導(dǎo)的心肌細(xì)胞間通訊[11]。上述研究結(jié)果，對于從基因水平闡明MI的病理變化具有積極意義，特別是心肌細(xì)胞間縫隙連接通路的Cx43及其上游CK1和PKC mRNA的變化規(guī)律，將為深化對MI后心律失常的發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識和從基因水平防治心律失常發(fā)生提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]McManus DD，Piacentine SM，Lessard D，et al.Thirty－year（1975 to 2005）trends in the incidence rates，clinical features，treatment practices，and short－term outcomes of patients ＜55years of age hospitalized with an initial acute myocardial infarction[J].Am J Cardiol，2011，108（4）：477－482.

[2]蘇懿，王磊，張敏州.急性心肌梗死的流行病學(xué)研究進(jìn)展[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2012，10（4）：467－469.

[3]Falsini G，Liistro F，Ducci K，et al.Shifting from pharmacological to systematic mechanical reperfusion therapy for acute myocardial infarction via a cooperating network：Impact on reperfusion rate and in－h(huán)ospital mortality[J].J Cardiovasc Med （Hagerstown），2008，9（3）：245－250.

[4]Henkel DM，Witt BJ，Gersh BJ，et al.Ventricular arrhythmias after acute myocardial infarction：A 20－year community study[J].Am Heart J，2006，151（4）：806－812.

[5]吳愛明，張冬梅，婁利霞，等.生脈注射液聯(lián)合血塞通注射液對心肌梗死大鼠室顫閾值和心肌連接蛋白43表達(dá)的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2011，9（7）：775－782.

[6]郭新紅，姜孝成，潘曉玲，等.基因芯片技術(shù)與基因表達(dá)譜研究[J].生物學(xué)雜志，2001，18（5）：1－2.

[7]Mayama T，Matsumura K，Lin H，et al.Remodelling of cardiac gap junction connexin 43and arrhythmogenesis[J].Exp Clin Cardiol，2007，12（2）：67－76.

[8]Patel PM，Plotnikov A，Kanagaratnam P，et al.Altering ventricular activation remodels gap junction distribution in canine heart[J].J Cardiovasc Electrophysiol，2001，12（5）：570－577.

[9]Beardslee MA，Lerner DL，Tadros PN，et al.Dephosphorylation and intracellular redistribution of ventricular connexin 43during electrical uncoupling induced by ischemia[J].Circ Res，2000，87（8）：656－662.

[10]Cooper CD，Lampe PD.Casein kinase 1regulates connexin－43gap junction assembly[J].J Biol Chem，2002，277（47）：44962－44968.

[11]Lampe PD，TenBroek EM，Burt JM，et al.Phosphorylation of connexin 43on serine 368by protein kinase C regulates gap junctional communication[J].J Cell Biol，2000，149（7）：1503－1512.