曾 義

(重慶市黔江中心醫(yī)院，重慶 409000)

維生素D缺乏不僅與骨質(zhì)疏松癥和骨軟化癥相關(guān)，而且容易導(dǎo)致肌肉力量下降，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)維生素D與癌癥、心血管疾病、糖尿病等都有相關(guān)性，足量的體內(nèi)維生素D水平對(duì)癌癥、多發(fā)性硬化癥、糖尿病等有一定預(yù)防作用[1]。國(guó)外研究表明，維生素D的攝入與癌癥的預(yù)防呈正相關(guān)，血清低水平維生素D與較高的外周動(dòng)脈疾病發(fā)病率存在關(guān)聯(lián)[2]。維生素D有兩種存在形式，即鈣化醇(維生素D2)和膽固醇(維生素D3)。維生素D狀況評(píng)估主要是通過(guò)測(cè)量循環(huán)中血清25－(OH)－D水平。傳統(tǒng)檢測(cè)方法采用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)和免疫測(cè)定法來(lái)檢測(cè)循環(huán)中總的維生素D(D2和D3)，這些方法中抗體交叉反應(yīng)性通常不足100%[3]，因此結(jié)果差異較大。采用液－質(zhì)聯(lián)用分析技術(shù)可克服以上缺點(diǎn)，并定量檢測(cè)體內(nèi)維生素D。

1 儀器與試藥

安捷倫1200型液相色譜儀和安捷倫6430型液質(zhì)聯(lián)用儀。25－(OH)－D2(99.5%)，25－(OH)－D3(99.0%)，均為上海研生生化試劑有限公司;氘代25－(OH)D3(Sigma and Medical lsotopes);甲醇、乙腈為色譜純，甲酸等為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

25－(OH)－D2標(biāo)準(zhǔn)溶液:以甲醇配制 10 μg/mL的 25－(OH)－D2貯備液，在15℃以下儲(chǔ)存，備用;用5%牛血清蛋白的溶液制備 5，10，25，50，100 ng/mL 的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。25 －(OH)－D3標(biāo)準(zhǔn)溶液配制如25－(OH)－D2對(duì)照品溶液配制。以甲醇配置10 μg/mL的氘代25－(OH)－D3貯備液，儲(chǔ)存在15℃以下備用;用去離子水制備400 ng/mL的氘代25－(OH)－D3溶液作為內(nèi)標(biāo)貯備溶液。

2.2 測(cè)定條件[4]

色譜條件:色譜柱為C18柱，流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液－0.1%甲酸的甲醇溶液(15∶85)，檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm，柱溫50℃，流速 0.5 mL/min，進(jìn)樣量 5 μL。

質(zhì)譜條件:ESI+APCI組合離子源，正離子模式;離子源噴射電壓5 000 V，離子源溫度250℃，離子源噴霧流速5 L/min。此條件下，總離子流色譜圖見(jiàn)圖1。

2.3 樣品前處理

空白血清前處理:用Chromabond C18EC固相萃取柱萃取血清樣品，在250 μL血清中加入1 mL含2%甲酸的乙腈，靜置15 min;將固相萃取柱安裝在其專用真空架上，3 000 r離心10 min，順序用1×1 mL甲醇，1×1 mL甲醇，去離子水(50∶50)淋洗固相萃取柱，然后將離心管的上清液轉(zhuǎn)移至與預(yù)活化的固相萃取柱上。再次用1×1 mL甲醇，1×1 mL甲醇，去離子水(50∶50)淋洗固相萃取柱。開(kāi)啟真空30 s，然后每個(gè)柱子加200 μL正庚烷，靜置2 min，然后將真空開(kāi)至最大6 min。然后用甲醇和去離子水250 μL 順序洗脫。

血清樣品前處理:用Chromabond C18ec固相萃取柱萃取血清樣品，在250 μL血清樣品中加入內(nèi)標(biāo)溶液50 μL，方法同空白血清前處理。

2.4 維生素D2、維生素D3以及氘代內(nèi)標(biāo)的分析參數(shù)

結(jié)果見(jiàn)表1。

2.5 方法學(xué)考察

圖1 總離子流色譜圖

表1 維生素D2、維生素D3以及氘代內(nèi)標(biāo)的分析參數(shù)

線性考察:精密量取2.1項(xiàng)下25－(OH)－D2和25－(OH)－D3標(biāo)準(zhǔn)溶液，加流動(dòng)相稀釋至質(zhì)量濃度 5，10，25，50，100 ng/mL，分別進(jìn)樣5 μL。記錄峰面積，以質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)、峰面積(A)為縱坐標(biāo)作圖，得 25－(OH)－D2和 25－(OH)－D3回歸方程分別為 A=0.015 8 C+0.002 7，R2=0.999 2;A=0.034 8C －0.013 5，R2=0.999 5。結(jié)果表明，25－(OH)－D2和 25－(OH)－D3質(zhì)量濃度在5～100 ng/mL范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系。

日內(nèi)精密度試驗(yàn):精密量取2.1項(xiàng)下25－(OH)－D2和25－(OH)－D3標(biāo)準(zhǔn)溶液，流動(dòng)相配制為 10，25，50 ng/mL 的高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度的25－(OH)－D2和25－(OH)－D3溶液各3份。按2.2項(xiàng)下測(cè)定條件，每個(gè)質(zhì)量濃度分別進(jìn)樣進(jìn)行含量測(cè)定，記錄色譜峰面積。結(jié)果25－(OH)－D2和25－(OH)－D3高、中、低3 個(gè)濃度日內(nèi)精密度 RSD 分別為 3.71% ，2.66% ，1.29% 和3.57%，2.21%，1.53%，RSD 均小于 5%，表明日內(nèi)精密度較好。

日間精密度、穩(wěn)定性試驗(yàn):精密量取2.1項(xiàng)下25－(OH)－D2和25－(OH)－D3對(duì)照品溶液，流動(dòng)相配制為10，25，50 ng/mL的高、中、低3個(gè)濃度的25－(OH)－D2和25－(OH)－D3溶液，密封避光于4℃保存。按2.2項(xiàng)下色譜條件，同一溶液進(jìn)樣含量測(cè)定5 d，記錄色譜峰面積，計(jì)算供試品測(cè)得的質(zhì)量濃度。計(jì)算得25－(OH)－D2和25－(OH)－D3高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度日內(nèi)精密度RSD 分別為 7.10%，5.25%，4.69%和 6.87%，5.30%，4.03%。結(jié)果5 d內(nèi)含量測(cè)定 RSD都小于10%，表明該方法日內(nèi)精密度好，且5 d內(nèi)25－(OH)－D2和25－(OH)－D3穩(wěn)定性較好。

提取回收率:取質(zhì)量濃度為10，25，50 μg/L的血清標(biāo)樣50 μL各5份，按2.3項(xiàng)下樣品處理方法處理后，氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?0 μL流動(dòng)相復(fù)溶解，渦旋 2 min，12 000 r/min離心 10 min，血清處理后25－(OH)－D2和25－(OH)－D3質(zhì)量濃度的理論推算值為 9.9，24.75，49.5 μg/L 和 9.95，24.87，49.75 μg/L，取 5 μL注入高效液相色譜－質(zhì)譜儀，測(cè)定樣品峰面積A。另用流動(dòng)相配制 9.9，24.75，49.5 μg/L 和 9.95，24.87，49.75 μg/L 質(zhì)量濃度的 25－(OH)－D2和 25－(OH)－D3溶液，進(jìn)樣 5 μL，記錄峰面積 A，按提取回收率公式為提取回收率=A血清/A標(biāo)準(zhǔn)×100%。結(jié)果提取回收率分別為 83.23% ，80.55% ，76.34% 和 85.21% ，83.10%，79.44%，RSD 均小于 8%。

回收率試驗(yàn):取 2.1項(xiàng)下 25－(OH)－D2和 25－(OH)－D3標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制質(zhì)量濃度為 5.0，10.0，25.0，50.0，100.0 μg/L 的血漿標(biāo)樣各5份，按2.3項(xiàng)下血清樣品處理方法處理后，取5 μL注入高效液相色譜－質(zhì)譜，測(cè)定藥物峰面積 A及內(nèi)標(biāo)峰面積 A內(nèi)，計(jì)算藥物峰面積與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值 Y(A/A內(nèi))，按回歸方程 A=0.016 0 C+0.002 9，A=0.033 5 C －0.013 8 求出對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度。結(jié)果25－(OH)－D2和25－(OH)－D3的方法回收率分別 為 108.23% ，100.56% ，98.73% ，96.19% ，98.55% 和106.16% ，101.15% ，100.53% ，99.17% ，97.10% ，RSD 分別為7.02% ，5.71% ，4.43% ，3.80% ，2.01% 和 6.72% ，3.14% ，3.49% ，3.32% ，1.65%。

2.5 真實(shí)樣品檢驗(yàn)與檢測(cè)限

采用預(yù)先定量的新鮮血清樣品對(duì)該法進(jìn)行了驗(yàn)證，定量結(jié)果與以前高效液相色譜法結(jié)果相關(guān)性良好，相關(guān)系數(shù)為 R2=0.978。兩種維生素 D的檢測(cè)限和定量限分別為2 ng/mL和3 ng/mL。部分樣品含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 血清樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

本研究中采用了一種新的液質(zhì)聯(lián)用方法檢測(cè)血清中25－羥基維生素D2或D3的含量，采用固相萃取樣品制備方法，有效抑制基質(zhì)效應(yīng)和由脂類及血清中其他化合物導(dǎo)致的離子抑制效應(yīng)。

本試驗(yàn)中采用高效液相色譜－質(zhì)譜法進(jìn)行血清中維生素D的含量的測(cè)定，與常規(guī)高效液相色譜法、競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)、免疫測(cè)定法比較，可同時(shí)血清中維生素D2和維生素D3的含量，且測(cè)定分析時(shí)間短，分析結(jié)果更準(zhǔn)確、可靠，可作為血清中維生素D檢測(cè)的新方法，為臨床中合理補(bǔ)充D族維生素、臨床相關(guān)疾病的診斷提供參考。

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