柳一鳴 夏志月 歐陽健明＊, 賈麗萍 張廣娜 丁一鳴

(1湖南理工學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，岳陽 4 140001)

(2暨南大學(xué)生物礦化與結(jié)石病防治研究所，廣州 5 10632)

泌尿系結(jié)石(簡稱尿石)已經(jīng)成為威脅人類健康的一種常見病、多發(fā)病[1-2]，目前對其預(yù)防還沒有十分有效的方法，結(jié)石形成的機(jī)制尚不清楚[3-4]。尿石的主要成分有草酸鈣、磷酸鈣、尿酸、磷酸銨鎂、胱氨酸等，其中約80%為含鈣結(jié)石[5]。

尿石形成包括尿石晶體的成核、生長、聚集和粘附等過程[6-7]。尿液中病理性微晶(微米級)滯留在腎臟中后，會繼續(xù)生長和/或聚集，最終形成結(jié)石(毫米級)。因此，尿微晶與尿石存在著密切的關(guān)系。尿液中某種晶體消失，此類尿石復(fù)發(fā)的傾向就減??；而尿微晶持續(xù)或重新出現(xiàn)常常預(yù)示著成石活躍或結(jié)石病復(fù)發(fā)[6,8]。有報道[9]表明，即使在健康人尿液中，尺寸大于5μm的微晶亦多達(dá)78 000 mL-1。結(jié)石患者尿液中尺寸大于12μm的微晶數(shù)目占尿液中微晶總數(shù)的16%～65%，而健康人尿液中大于12μm的微晶僅占尿微晶的13%以下，從而得出結(jié)石患者尿液中的微晶更易沉積在腎小管或尿路狹窄部位形成結(jié)石。

尿液中存在抑制尿石鹽生長的物質(zhì)，包括尿小分子(如檸檬酸鹽、焦磷酸鹽等)和尿大分子[如酸性粘多糖(GAGs)、腎鈣素、凝血酶原片段1、骨橋蛋白(OPN)、肌醇六磷酸、蛋白質(zhì)總量和TH蛋白等]，它們大多為陰離子。正常人和尿石病人尿液中的上述抑制劑不僅在濃度上存在差異，而且在結(jié)構(gòu)和活性上存在差異[10-11]。

本文比較研究了健康人尿微晶與結(jié)石患者尿微晶的生長過程，找出了其中的差異，期望為探索尿石形成機(jī)理、預(yù)防尿石形成提供啟示。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

XL-30型環(huán)境掃描電子顯微鏡SEM(Philips公司)。X射線粉末衍射儀(D8FOCUS，德國Bruker公司)。CaCl2和Na2Oxa等化學(xué)試劑均為分析純，購自上?；瘜W(xué)試劑公司。配制20 mmol·L-1的CaCl2和Na2Oxa貯備液。

1.2 尿樣收集和處理

(1)標(biāo)本來源：收集暨南大學(xué)第一附屬醫(yī)院碎石中心主要組分為CaOxa的結(jié)石患者的新鮮晨尿5例，其中男3名，女2名，年齡32～58歲，平均年齡44．2歲；5名對照者為無結(jié)石病史的健康體檢者，來自暨南大學(xué)師生，其中男3名，女2名，年齡22～53歲，平均年齡 41．6 歲。

(2)尿樣處理方法：收集新鮮晨尿后，立即加入2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的疊氮化鈉溶液防腐 (加入量為10 mL·L-1尿液)，一部分尿液用于檢測其中的Ca2+和Oxa2-濃度；另一部分在常溫下離心15 min(4 000 r·min-1)，除去細(xì)胞碎片，然后加入相當(dāng)于尿液體積20%的 0．15 mol·L-1的 NaCl溶液稀釋尿液，備用。

1.3 尿液中Ca2+、Oxa2-、檸檬酸鹽和葡胺聚糖(GAGs)含量檢測

分別采用火焰原子吸收光譜法、高錳酸鉀褪色法、阿利辛藍(lán)比色法和偏釩酸銨活化催化動力學(xué)光度法[12-14]測定上述5例結(jié)石患者和5例對照者尿液中的鈣、草酸根(Oxa2-)、檸檬酸鹽和GAGs的含量，結(jié)果見表1，結(jié)石患者和對照者之間均存在顯著性差異(p＜0．05)。

表1 五例健康者和五例患者尿液中的Ca2+、Oxa2-、檸檬酸鹽、GAGs和OPN濃度Table 1 Concentrations of Ca2+,Oxa2-,citrate,GAGs and OPN in urines of 5 patients with renal stones and 5 healthy subjects

1.4 尿微晶生長動力學(xué)研究

在上述兩類稀釋尿液中加入濃度為20 mmol·L-1的CaCl2和Na2Oxa溶液，加入量根據(jù)原尿中Ca2+L-1；然后分為數(shù)份，放入50 mL的培養(yǎng)皿中，在每個培養(yǎng)皿底部預(yù)先放置3片洗凈的石英基片，置入37℃的恒溫箱中，讓尿液慢慢揮發(fā)析出晶體，并在放置時間t=1、8和48 h時各取出1片基片，用蒸餾水小心洗去基片表面的尿液，在真空干燥器中干燥1 d后，用XRD分析微晶的組分，用SEM檢測微晶的形貌和尺寸；在統(tǒng)計微晶尺寸和數(shù)量時，各選擇4個代表性的微晶區(qū)域 (面積均為1 mm×1 mm)，取平均值。實驗平行2次。

1.5 統(tǒng)計學(xué)

應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，分別采用單因素方差分析，計量資料采用(x±t)表示，組間比較用SNK法和LSD法。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)石患者和對照者尿微晶的生長動力學(xué)差異

表2列出了CaOxa結(jié)石患者和對照者尿微晶在生長不同時間后的尺寸和數(shù)量變化，其代表性SEM圖片見圖1和圖2。可以看出，兩類尿微晶的生長存在如下差異：

(1)尿微晶尺寸隨時間的變化差異

隨著生長時間 (t)從1 h增加到8 h和48 h，CaOxa結(jié)石患者尿液中的微晶尺寸顯著增大，如t=1 h 時微晶尺寸約為(6±4)μm(圖 1a)，t=8 h 時，其尺寸增加至(11±8)μm(圖 1b)，而 t=48 h 時(圖 1c)，增加至(29±17)μm，大部分尿微晶的尺寸在20μm以上，晶體的聚集程度增加。這說明，在結(jié)石患者尿液中，CaOxa晶體的形成主要為生長控制，即：隨著生長時間的延長，尿晶體尺寸不斷增長。

相比之下，對照者尿微晶的結(jié)晶規(guī)律(圖2)與結(jié)石患者有所不同。隨著t從1 h增加到48 h，對照者的尿微晶尺寸緩慢增長，尺寸僅從(6±5)μm增加至(15±9)μm，絕大部分尿微晶尺寸仍然在20μm以下，微晶分布均勻。這說明，在對照者尿液中，微晶的生長過程同時為成核控制和生長控制。

以前的報道[9,15-17]認(rèn)為，結(jié)石患者的尿微晶尺寸顯著大于對照者，如Tiselius[17]報道了CaOxa結(jié)石患者尿微晶的平均尺寸為4.57μm，大于正常人的4．47μm，并且結(jié)石患者尿微晶聚集明顯比患者嚴(yán)重得多。Abdel-Halim等[16]研究了結(jié)石患者和對照者的新鮮晨尿及其放置6 h、24 h后的尿微晶，發(fā)現(xiàn)患者晨尿中出現(xiàn)結(jié)晶尿的頻率(9．3%)比對照者(2%)的高，放置6 h兩者的區(qū)別不大，而放置24 h后，患者尿樣中出現(xiàn)結(jié)晶尿的頻率增加到27．1%，顯著大于對照者的12%；在患者尿樣中，不管是晨尿還是放置24 h后尿液，均存在微晶聚集現(xiàn)象，但對照者尿液中沒有?；颊吣蛭⒕У木奂嬖趦煞N情況：一種是不同微晶相互靠攏，形成大尺寸的微晶(如圖1c，2a)；另一種是小尺寸的微晶在大尺寸微晶的表明不斷沉積(如圖 3c)。

(2)尿微晶數(shù)密度隨時間的變化差異

對于結(jié)石患者尿液，隨著生長時間的延長，不但尿微晶尺寸顯著增加，而且微晶數(shù)密度顯著減少(表2)，如在t=1、8和48 h時，其微晶數(shù)密度分別為(1 400±300)、(950±210)和(450±140)mm-2。 即：隨著生長時間增加，患者尿液中的小尺寸微晶在不斷消失，而大尺寸的尿微晶則進(jìn)一步生長，特別是在t=48 h時，患者尿液中小尺寸的微晶顯著減少。SEM結(jié)果(圖1c)表明，的確在大尺寸的尿晶體表面有小尺寸的微晶沉積。

而對照者尿樣在分別生長1、8和48 h后，其微晶數(shù)密度分別為(850±260)、(700±190)和(610±210)mm-2(表2)，即：微晶數(shù)密度隨生長時間增加而緩慢減少，尺寸則緩慢增加。

上述兩類尿微晶的尺寸和數(shù)量變化規(guī)律可以從下面幾個方面得到解釋：

(1)根據(jù)尺寸-溶解度 (Gibbs-Thomson)關(guān)系式(1)[18]，體系中粒徑不同的粒子，在體系中的溶解度也不同。當(dāng)分散于溶液中的粒子尺寸較小時，溶液中該粒子的溶解度c(r)會遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其正常的平衡飽和度值，即溶解度會顯著提高，特別是當(dāng)溶液中粒子的粒徑r＜1μm時，溶解度的增加更為明顯。當(dāng)小尺寸的尿微晶在尿液中溶解導(dǎo)致尿液過飽和后，尿液中的尿石鹽組分又會沉積到尺寸較大的尿微晶表面上，致使尿液中尿石鹽的過飽和度減小，然后尿液又進(jìn)一步溶解其余的小尺寸粒子，如此反復(fù)的溶解-沉積-再溶解-再沉積過程，致使尿液中小尺寸的尿微晶慢慢消失，而大尺寸的尿微晶則不斷長大。

式中c(r)為粒徑為r的粒子的溶解度，c*為大粒子(r→∞)的平衡飽和度，M為溶液中固體的物質(zhì)的量質(zhì)量，γ為界面張力，ν為難溶電解質(zhì)中的離子物質(zhì)的量數(shù) (對于非電解質(zhì)，ν=1)，R為氣體常數(shù)，T為絕對溫度，ρ為固體的密度，v(M/ρ)為固體溶解物的物質(zhì)的量體積。

(2)由于尺寸較小的粒子的比表面積較大，即所處能態(tài)較高，尺寸較大的粒子則比表面積較小，即所處能態(tài)較低，而體系中的固相有調(diào)節(jié)自己以獲得最小表面自由能的趨勢，因此，許多小粒子易轉(zhuǎn)化成大粒子而進(jìn)入低能態(tài)，即小粒子會慢慢消失，而大粒子不斷長大[19]。

從圖1a可以看出，患者尿液中的粒子分布不均勻，大粒子和小粒子之間顯著的比表面積差異和溶解度差異，使得小尺寸尿微晶隨尿液放置時間逐漸消失，而大尺寸尿微晶逐漸長大(圖1b，1c)；同時，由于小尺寸微晶不斷溶解、消失，導(dǎo)致尿微晶總數(shù)隨尿樣放置時間的增加而減少(表2)。

而對照者的尿微晶尺寸較為均勻(圖2a)，大、小粒子之間的比表面積和溶解度差異均比患者的小，即：粒子間的相互作用力和表面自由能差異較小，發(fā)生聚集的驅(qū)動力也減小，使得對照者尿液體系較為穩(wěn)定，因而不容易結(jié)晶生成大尺寸的晶體粒子。

(3)歸因于結(jié)石患者尿液中的抑制劑(包括尿大分子和尿小分子)濃度和活性均比對照者的顯著降低[20-21]。在我們研究的5例對照者和5例患者尿液中，GAGs的含量分別為 (8．80±1．92) 和 (5．18±1．19)mg·L-1(表 1)，檸檬酸鹽的含量分別為(228±123)和(153±79)mg·L-1。尿抑制劑的濃度降低后，其與Ca2+離子的配位能力減小，導(dǎo)致患者尿液中Ca2+離子的擴(kuò)散系數(shù)(D)增加，故在患者尿液中含Ca2+尿石鹽(如CaOxa、磷酸鈣等)的生長速度比在對照者尿液中的增加，產(chǎn)生的尿石鹽微晶尺寸比對照者的大。有關(guān)結(jié)石患者尿液中的尿大分子與對照者的差異，在本文的后半部分還將詳細(xì)討論。

上述結(jié)果(圖1和2)可從理論上解釋為什么對照者不形成結(jié)石而患者可以形成結(jié)石：對于患者，隨著每日Ca2+和Oxa2-等尿石鹽組分的攝入，尿石鹽(如CaOxa等)晶體會在尿液中不斷長大，從而形成大體積的微晶粘附在尿路的細(xì)胞上，最終形成結(jié)石；而在對照者尿液中，Ca2+和Oxa2-等尿石鹽組分的攝入對微晶尺寸的貢獻(xiàn)不很明顯(圖2)，由于大量中、小尺寸的尿微晶容易隨尿液而排出體外，因而不易形成結(jié)石。

2.2 結(jié)石患者與對照者尿微晶的差異

圖3和4分別為結(jié)石患者和對照者在t=1 h時尿微晶的SEM照片，比較可以看出如下差異：

(1)形貌和聚集狀態(tài)

結(jié)石患者尿微晶(圖3)存在如下3個明顯的特征：(a)棱角尖銳；(b)聚集的微晶較多；(c)可見一些小晶體沉積在大晶體上。

相比之下，對照者尿微晶存在3個與患者近似相反的特征：(a)尿微晶棱角較為圓鈍；(b)聚集的晶體較少；(c)大晶體表面再次沉積小晶體的現(xiàn)象較少。

對5例結(jié)石患者和5例對照者的尿微晶的統(tǒng)計表明，在對照者的微晶中，90%的微晶粒徑小于20μm，而結(jié)石患者的尿微晶從1μm到220μm不等，大尺寸微晶顯著多于對照者?；颊吣蛭⒕С叽缭黾拥闹匾蛑皇蔷奂隆?/p>

兩類尿微晶的這種形貌和聚集差異與這兩類尿液中存在的抑制劑(包括尿大分子、尿小分子)物種、濃度和活性密切相關(guān)。雖然尿液過飽和(導(dǎo)致了尿微晶形成)是尿石形成的先決條件，然而，結(jié)石患者和對照者的尿草酸鈣均為過飽和，表1列出了本文所研究的5例患者和對照者尿液中Ca2+和Oxa2-的濃度。因此，對微晶形貌和聚集起重要作用的是尿液中存在的抑制劑濃度及其活性，包括GAGs、TH 蛋白、骨橋蛋白(OPN)、尿橋蛋白、腎鈣素(NC)、凝血酶原激活肽F1片段(UPTF1)等[9,10,20-24]。這些尿大分子大都帶有陰離子基團(tuán)或陰離子側(cè)鏈，它們抑制CaOxa成核、生長和聚集的能力大小取決于其分子的結(jié)構(gòu)、濃度和對尿微晶晶面位點的識別情況等[24]。例如，OPN更容易識別尿液中的二水草酸鈣(COD)晶體并與之結(jié)合；而UPTF1則更容易識別一水草酸鈣(COM)晶體。尿大分子的這種選擇性與尿液中的鈣濃度也有很大關(guān)系[23-24]。與結(jié)石患者相比，對照者尿液中含有的這些物質(zhì)不但種類較多，濃度較大，而且活性較強(qiáng)，如對照者尿液中的葡胺聚糖(GAGs)含量為(8.80±1.92)mg·L-1，明顯高于草酸鈣結(jié)石患者(5.18±1.19)mg·L-1(見表 1)；檸檬酸鹽含量((228±123)mg·L-1)亦比結(jié)石患者的((153±79)mg·L-1)高(文獻(xiàn)[25]結(jié)果分別為(264±144)mg·L-1和(202±142)mg·L-1)。同樣，對照者尿液中骨橋蛋白(OPN)含量(88.79±35.28)mg·L-1也比結(jié)石患者 (35.77±27.92)mg·L-1高得多[20]。

這些尿大分子和檸檬酸鹽與Ca2+離子之間存在配位作用，例如Wesson等[26]研究發(fā)現(xiàn)，OPN通過其羧基和磷酸基位點與COM中含Ca2+豐富的[100]、[120]、[010]晶面作用，從而抑制COM的形成和聚集；OPN還能以多聚天冬氨酸序列(ploy-Asp(86-93))與COD晶面Ca2+結(jié)合[22]，促進(jìn)COM向COD轉(zhuǎn)化，而COD與腎上皮細(xì)胞的粘附能力小，易隨尿液排除體外[23]，從而減少結(jié)石的生成。Mustafi等[27]研究發(fā)現(xiàn)，每微摩爾硫酸軟骨素二糖單位可與0.757μmol游離Ca2+結(jié)合，而NC可以通過γ-羧基谷氨酸中的氧原子與 Ca2+離子以4∶1定量結(jié)合；UPTF1的N-末端區(qū)域有10個谷氨酸殘基，對Ca2+的結(jié)合能力大小與谷氨酸上的γ-羧基化程度成正比[28]。特別是檸檬酸鹽，不但可與鈣離子配位形成可溶性的配合物檸檬酸鈣，而且可以封閉CaOxa生長的活性位點，抑制CaOxa的成核和生長，此外，檸檬酸鹽還可以誘導(dǎo)二水草酸鈣(COD)和三水草酸鈣(COT)形成，而COD和COT的形成可以減小CaOxa結(jié)石形成的危險性[29]。

因此，在對照者尿液中，這些抑制劑可與尿液中CaOxa微晶表面上的Ca2+離子存在配位-離解平衡，在這個動態(tài)過程中，CaOxa晶體表面上的Ca2+離子(尤其是在晶體周邊的Ca2+離子)不斷被上述尿大分子所溶解，溶解后的Ca2+離子同時也不斷地沉積到CaOxa晶面上，這種永不停止的溶解-沉積作用使得對照者尿液中的微晶棱角較為圓鈍，甚至可以看到晶體表面亦有被溶解的現(xiàn)象(圖2c)。而結(jié)石患者尿液中因為缺少這些抑制劑或者其濃度較低，CaOxa晶體的沉淀-溶解動態(tài)平衡要弱得多，因此微晶的棱角較尖銳(圖1c)。

(2)組分差異

從SEM的形貌可以看出，患者尿微晶中有較多的COM 晶體(圖 1a，1b,圖 3)，對照組中則有四方錐形的COD晶體(圖2a,圖4b)。采用XRD圖對尿微晶進(jìn)行了進(jìn)一步的表征，結(jié)果如圖5所示，其中圖5a、5b分別為圖 3a、3b患者尿微晶的XRD圖，圖5c、5d為對應(yīng)圖4a、4b的對照組尿微晶的XRD圖。與標(biāo)準(zhǔn)XRD圖比較，出現(xiàn)在d=0.365、0.297、0.249和0.198 nm的衍射峰歸屬于COM的 (020)、(202)、(112)和(303)晶面，d=0.393、0.316 和 0.290 nm 歸屬于尿酸的(211)、(121)和(221)面，d=0.413 和 0.328 nm歸屬于 MgNH4PO4·6H2O 的(021)和(130)面，d=0.278和0.226 nm歸屬于COD的(411)和(213)晶面。這表明，結(jié)石患者尿微晶主要為COM、COD、尿酸和MgNH4PO46H2O，而對照組尿微晶主要為尿酸、COD和COM等。

由于COM晶體與腎小管細(xì)胞的接觸程度比COD更大[30]，即COM與腎小管細(xì)胞表面有更強(qiáng)的結(jié)合力。理論計算也表明[31]，COM的確比COD對細(xì)胞膜有更強(qiáng)的親合力，因此，COD晶體將比COM晶體更容易隨尿液排出體外.如能生成更多的COD晶體，將有利于預(yù)防尿石的形成。

圖5b的基線較高，可能是以下原因造成：(1)由于尿微晶的量較少，導(dǎo)致背景干涉嚴(yán)重，玻璃峰相對增強(qiáng)；(2)尿液中的無定形物質(zhì)(如細(xì)胞碎片等)與尿微晶共同沉淀；(3)一些微晶的結(jié)晶度不高，特征峰表現(xiàn)較弱，使得儀器噪音看起來會比較明顯。

3 結(jié) 論

CaOxa結(jié)石患者與健康對照者的尿微晶及其生長過程均存在差異。對照者尿液中90%的微晶小于20μm，尺寸較為均一；而患者尿微晶尺寸差異大，從1μm到220μm不等，大尺寸的微晶顯著多于對照者尿液。對照者尿微晶多為圓形或橢圓形，而患者的尿微晶棱角尖銳，微晶的聚集程度遠(yuǎn)大于對照者?；颊吣蛭⒕е蠧OM的含量明顯比對照者的多?；颊吣蛭⒕У男纬蛇^程為生長控制，即隨著生長時間增加，尿微晶的尺寸不斷增大，數(shù)量減少，且出現(xiàn)聚集現(xiàn)象；而對照者尿微晶的生長過程同時為成核控制和生長控制。上述差異歸因于兩類尿液中的抑制劑濃度及其活性存在差異。

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