吳 笛 葉秋雄 王德勤 覃仁安

(廣州白云山和記黃埔中藥有限公司現(xiàn)代中藥研究院，廣州，510515)

復(fù)方丹參片由丹參、三七、冰片3味中藥組成，三七為其主要成分之一。《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版一部［1］復(fù)方丹參片項(xiàng)下有皂苷類成分的薄層色譜鑒別方法，以三七皂苷 R1、人參皂苷 Rg1、人參皂苷Rb1為檢測(cè)指標(biāo)，但缺乏皂苷類成分的含量測(cè)定，不能全面反映復(fù)方丹參片的質(zhì)量。文獻(xiàn)［2－7］顯示，三七、復(fù)方丹參片中單體皂苷含量測(cè)定的方法有薄層掃描法、高效液相色譜法，但薄層掃描法在定量分析的準(zhǔn)確度、精密度、穩(wěn)定性等方面均存在不足，目前薄層掃描法定量已被淘汰;HPLC－UV法因皂苷類成分的紫外吸收均為末端吸收，使用紫外檢測(cè)器檢測(cè)時(shí)，往往靈敏度低，基線易發(fā)生漂移，梯度洗脫時(shí)更易發(fā)生基線漂移，不利于檢測(cè)。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)是一種質(zhì)量型檢測(cè)器，其響應(yīng)與被測(cè)物質(zhì)的質(zhì)量成正比，而不依賴于被測(cè)物質(zhì)的光學(xué)性質(zhì)，只要樣品的揮發(fā)性低于溶劑的揮發(fā)性即可被檢測(cè)，尤其適用于流動(dòng)相有紫外吸收干擾、梯度洗脫時(shí)的基線漂移影響的情況，克服了紫外檢測(cè)器的不足。我們采用HPLC－ELSD法建立復(fù)方丹參片中皂苷類成分含量測(cè)定的新方法，旨在完善復(fù)方丹參片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以更好地控制復(fù)方丹參片的質(zhì)量。

1 儀器、試劑與試藥

1.1 儀器 美國(guó)戴安公司Dionex UltiMate 3000高效液相色譜儀;美國(guó)奧泰公司Alltech 3300 ELSD檢測(cè)器;色譜柱:Waters Symmetry C18(4.6mm ×250mm，5μm)，Waters Sunfire C18(4.6mm ×250mm，5μm)，Ecosil C18(4.6mm ×250mm，5μm)，Merck Purospher STAR RP －18e(4.6mm ×250mm，5μm)，Agilent TC － C18(4.6mm×250mm，5μm)，Inertsil ODS －3(4.6mm ×250mm，5μm)，Phenomenex Luna 5u C18(2)(4.6mm ×250mm，5μm)，Phenomenex Gemini 5u C18110A(4.6mm ×250mm，5μm)，Diamonsil C18(2)5u(4.6mm ×250mm，5μm);電熱數(shù)字顯示恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);Sartorius BT214D分析天平(萬分之一);Sartorius CP225D分析天平(十萬分之一)。

1.2 試劑 乙腈為色譜純，購(gòu)于美國(guó)TEDIA公司;甲醇為分析純;水為蒸餾水，購(gòu)于廣州屈臣氏食品飲料有限公司。

1.3 試藥 對(duì)照品三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所，純度大于98%;復(fù)方丹參片樣品共14批，其中4批由廣州白云山和記黃埔中藥有限公司提供，其他購(gòu)于各地藥店。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以乙腈為流動(dòng)相A，水為流動(dòng)相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫，流速1.0mL·min－1;柱溫25℃;蒸發(fā)光散射檢測(cè)器漂移管溫度50℃，載氣流速1.5L·min－1。理論板數(shù)按三七皂苷R1峰計(jì)算應(yīng)不低于4000。

表1 梯度洗脫程序

2.2 對(duì)照品溶液的制備 取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每 1mL 各含 20.56μg、80.64μg、80.48μg、20.12μg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取本品10片，除去糖衣或薄膜衣，研細(xì)，取約1.2g，精密稱定，精密加入甲醇60mL，稱定重量，放置過夜，置80℃水浴上回流2h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性樣品溶液的制備 按照處方比例稱取除去三七的其他藥材適量，按照復(fù)方丹參片的制法和供試品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照溶液，即得。

2.5 測(cè)定法 分別精密吸取對(duì)照品溶液5μL、20μL，供試品溶液10μL，陰性樣品溶液10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，用外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程計(jì)算復(fù)方丹參片中各指標(biāo)成分的含量。對(duì)照品、復(fù)方丹參片樣品和陰性樣品的色譜圖見圖1，陰性樣品在各指標(biāo)成分相應(yīng)的保留時(shí)間處無干擾。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 線性關(guān)系、檢測(cè)限(LOD)和定量限(LOQ)取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷 Rb1、人參皂苷Rd對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL各含0.514mg、2.016mg、2.012mg、0.503mg 的溶液，作為儲(chǔ)備液。取儲(chǔ)備液，稀釋為7個(gè)不同濃度，按上述色譜條件進(jìn)行HPLC分析。以對(duì)照品濃度的常用對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積的常用對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，得到各指標(biāo)成分的線性回歸方程和線性范圍。逐步稀釋對(duì)照品溶液，按信噪比3和10分別計(jì)算各指標(biāo)成分最低檢測(cè)限(LOD)和最低定量限(LOQ)。結(jié)果見表2。

圖1 對(duì)照品(A)、復(fù)方丹參片樣品(B)和陰性樣品(C)的色譜圖

表2 線性關(guān)系、檢測(cè)限(LOD)和定量限(LOQ)

2.6.2 精密度 日內(nèi)精密度:每3h 1次，以對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算得三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd峰面積積分值的RSD分別為 1.14%、0.52%、0.48%、0.31%，符合要求。日間精密度:每天3次，以對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣3d，計(jì)算得三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd峰面積積分值的RSD分別為2.29%、0.96%、2.13%、2.89%，符合要求。

2.6.3 重復(fù)性 取同一樣品6份，每份稱取約1.2g，精密稱定，按上述供試品溶液的制備方法平行制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd含量的RSD分別為0.77%、0.73%、0.80%、1.61%，顯示該法重復(fù)性良好。

2.6.4 穩(wěn)定性 取“重復(fù)性”下同一供試品，0、3、6、9、12、24h連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄24h內(nèi)峰面積，計(jì)算得三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd峰面積積分值的 RSD 分別為 3.67%、3.08%、3.75%、3.23%，顯示各指標(biāo)成分在樣品溶液中至少24h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.6.5 加樣回收率 取已知含量的同一批次樣品約1.2g，精密稱定，精密加入高、中、低三個(gè)劑量的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd對(duì)照品，共9份，分別制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行分析。結(jié)果顯示:各指標(biāo)成分的加樣回收率均在95% ～105%之間，符合要求，見表3。

表3 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.7 耐用性 取同一供試品溶液，分別使用Waters Symmetry C18、Waters Sunfire C18、Ecosil C18、Merck Purospher STAR RP －18e、Agilent TC －C18、Inertsil ODS －3、Phenomenex Luna 5u C18(2)、Phenomenex Gemini 5u C18110A、Diamonsil C18(2)5u共9根不同廠牌的色譜柱在上述色譜條件下進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜圖并計(jì)算各指標(biāo)成分的含量。結(jié)果顯示:在不同色譜柱上各目標(biāo)化合物均能得到良好分離，含量測(cè)定結(jié)果誤差在允許范圍內(nèi)。

2.8 樣品測(cè)定 取不同廠家的復(fù)方丹參片樣品分別制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行HPLC分析，測(cè)定各指標(biāo)成分的峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果見表4。

表4 復(fù)方丹參片中4種皂苷的含量(mg·g－1，n=3)

3 討論

據(jù)文獻(xiàn)［8］報(bào)道，三七中的皂苷類活性成分包括人參皂苷 Rg1、Rg2、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rh1、F2及三七獨(dú)有的三七皂苷 R1、R2、R4、R5、Fa、Fc、Fe 等。對(duì)復(fù)方丹參片的甲醇提取液進(jìn)行HPLC分析，顯示人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1含量最高，其次為人參皂苷Rd、三七皂苷R1，其他皂苷類含量極低(見圖1)，故選擇人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、三七皂苷R1作為含量測(cè)定的檢測(cè)指標(biāo)。

我們?cè)陬A(yù)實(shí)驗(yàn)階段曾使用紫外檢測(cè)器對(duì)復(fù)方丹參片中皂苷類成分進(jìn)行檢測(cè)，參照《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版一部［1］三七項(xiàng)下皂苷類的含量測(cè)定方法選擇203nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，流動(dòng)相用乙腈－水系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果顯示基線嚴(yán)重漂移，雜質(zhì)干擾嚴(yán)重，各指標(biāo)成分分離較差，經(jīng)反復(fù)摸索也難以得到理想結(jié)果。后選用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示基線平穩(wěn)，雜質(zhì)干擾極小，各目標(biāo)峰峰形尖銳、分離良好，故選擇采用HPLC－ELSD法對(duì)復(fù)方丹參片中皂苷類成分進(jìn)行檢測(cè)。

考慮到所建立的含量測(cè)定新方法應(yīng)具有普遍適用性，對(duì)9根不同廠牌色譜柱進(jìn)行了詳細(xì)考察，結(jié)果顯示各指標(biāo)成分在9根色譜柱上均分離良好，含量測(cè)定結(jié)果誤差極小，說明此方法普適性較好。

因選擇作為檢測(cè)指標(biāo)的皂苷類化合物結(jié)構(gòu)類似，在多種溶劑中的溶解性趨向一致，故選擇與《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版一部［1］三七項(xiàng)下皂苷類含量測(cè)定方法一致的甲醇作為樣品提取溶劑。

對(duì)樣品提取方式進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示:超聲處理15min、30min、45min、60min、靜置過夜、靜置過夜后80℃水浴回流1h得到供試品中4個(gè)指標(biāo)成分的總含量均基本一致，而靜置過夜后80℃水浴回流2h、3h得到供試品中4指標(biāo)成分的總含量明顯高于其他6種處理方式?？紤]到操作的簡(jiǎn)便性，樣品的提取選擇靜置過夜后80℃水浴回流2h。

對(duì)提取溶劑甲醇的用量進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示，甲醇用量為60mL時(shí)，4指標(biāo)成分的總含量最高，故選擇用60mL甲醇提取、制備樣品。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典一部［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:904 －905，11.

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