竇傳字 吳煥淦 洪宗國(guó) 崔云華 周次利 馬曉芃 劉慧榮 呂 豐 郭金云

(1上海中醫(yī)藥大學(xué)上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所，上海，200030;2中南民族大學(xué)藥學(xué)院，武漢，430074)

灸法是中醫(yī)的基本療法，目前艾灸作用機(jī)制與安全性是灸法研究中亟待解決的兩大問(wèn)題［1］。艾灸燃燒生成物的研究已成為艾灸安全性研究的重要組成部分，現(xiàn)有研究主要集中在艾葉燃燒產(chǎn)生的穩(wěn)定化學(xué)成分［2－5］，卻忽略了艾灸過(guò)程中產(chǎn)生的自由基。自由基是含有單電子的化學(xué)基團(tuán)，反應(yīng)活性高，能與人體內(nèi)不同分子發(fā)生反應(yīng)。自由基影響酶的活化、參與白細(xì)胞免疫反應(yīng)和人的衰老過(guò)程，還能導(dǎo)致基因突變與細(xì)胞凋亡［6－7］。本工作擬采用電子自旋共振儀(ESR)，配合相應(yīng)的自由基捕捉劑和吸收液，對(duì)1年、3年、5年不同儲(chǔ)存年份艾條燃燒產(chǎn)生的自由基進(jìn)行研究，從自由基角度探討新陳艾的安全性，為新陳艾安全性評(píng)價(jià)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 湖北李時(shí)珍蘄艾制品廠產(chǎn)1年、3年、5年艾條。艾絨等級(jí)3∶1，直徑18 mm，長(zhǎng)度200 mm，重量22 g，含水量≤13%。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 苯(A.R.，北京益利精細(xì)化學(xué)有限公司)，F(xiàn)eSO4·7H2O(A.R.，北京化學(xué)試劑三廠)，乙酸乙酯(A.R.，北京化工廠)，鄰苯二酚、對(duì)苯二酚、連苯三酚、氫氧化鈉(A.R.，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，PBN(phenyl－tert－ butynitrone，美國(guó) SIGMA公司)，DETC(diethyldithiocarbamte，美國(guó) SIGMA 公司)，劍橋?yàn)V紙(Cambridge filter)，電子自旋共振儀(ESP300，德國(guó)BRUKER公司)，珠江9型自動(dòng)定時(shí)曝光器(廣州自動(dòng)化儀表廠)，ACO系列電磁式空氣泵(浙江森森實(shí)業(yè)有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備 1)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備:實(shí)驗(yàn)前將艾條放入硅膠干燥劑中平衡24 h。在通風(fēng)櫥內(nèi)搭建如圖1所示實(shí)驗(yàn)裝置，燃燒塔上方為倒置玻璃漏斗，玻璃管道中間以橡皮管相連，②為煙焦油捕集器，可更換濾紙，以捕集焦油自由基，③試管內(nèi)加有相應(yīng)自由基捕集劑，以捕集氣相自由基。

圖1 實(shí)驗(yàn)裝置

2)溶液配置:分別配制10 mmol/L的PBN苯溶液、含6 mmol/L DETC和3 mmol/L FeSO4的水溶液作為自由基捕集液，現(xiàn)配現(xiàn)用。配制0.1 mol/L鄰苯二酚、對(duì)苯二酚、連苯三酚和氫氧化鈉溶液，備用。

3)自由基捕集:使用時(shí)每次吸取1 mL捕集液加入③試管中，更換②中濾紙。點(diǎn)燃艾條置于①燃燒塔內(nèi)，待燃燒產(chǎn)生穩(wěn)定煙氣后即打開(kāi)空氣泵，使煙氣通過(guò)倒扣的漏斗進(jìn)入玻璃管道，經(jīng)②煙焦油捕集器捕捉焦油自由基，經(jīng)③試管中PBN捕集液或(DETC)2－Fe2+復(fù)合物捕捉氣相自由基。每個(gè)樣本抽取1 min，重復(fù)5次。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持實(shí)驗(yàn)室溫度為(22±2)℃，相對(duì)濕度為(55±10)%。

捕捉自由基完成后，將PBN捕集液移入1.5 mL EP管內(nèi)，編號(hào)，放入冰盒，即刻進(jìn)行ESR檢測(cè)。(DETC)2－Fe2+捕集液中加入0.3 mL乙酸乙酯，劇烈震蕩3 min，5000 g離心6 min，分離上清后低溫避光保存，用于ESR測(cè)定。將捕集焦油自由基后的濾紙編號(hào)，放入通風(fēng)柜內(nèi)攤開(kāi)經(jīng)24 h晾干，用于ESR檢測(cè)。

1.3.2 ESR波譜儀檢測(cè)條件 ESR波譜儀檢測(cè)前預(yù)熱1 h，室內(nèi)溫度控制為21℃。ESR波譜儀檢測(cè)條件如下表1所示，ESR檢測(cè)波段為X波段，焦油自由基檢測(cè)功率為1.02 mW，氣相自由基檢測(cè)功率為12.8 mW，微波頻率為9.75 Hz，調(diào)頻100 kHz，調(diào)幅2.88e+00G，時(shí)間常數(shù)為327.68 ms。

表1 波譜儀檢測(cè)條件

1.3.3 檢測(cè)方法 檢測(cè)時(shí)抽取捕集自由基后的PBN捕集液400 μL加入直徑為4 mm的玻璃檢測(cè)管內(nèi)，放入ESR檢測(cè)腔檢測(cè)。取收集到的乙酸乙酯溶液150 μL加入直徑2 mm的玻璃管內(nèi)，放入ESR檢測(cè)腔內(nèi)檢測(cè)。取晾干后的焦油自由基捕集濾紙，小心卷成條狀放入直徑為3 mm的透明塑料管內(nèi)，放入ESR檢測(cè)腔檢測(cè)。

檢測(cè)前將0.1 mol/L的鄰苯二酚、對(duì)苯二酚和連苯三酚分別與氫氧化鈉溶液按1∶1體積混合，即刻用于ESR檢測(cè)，檢測(cè)條件與焦油自由基相同。

2 結(jié)果

2.1 艾條燃燒產(chǎn)生自由基的ESR圖譜

2.1.1 不同儲(chǔ)存期艾條燃燒產(chǎn)生焦油自由基圖譜焦油中自由基用濾紙捕集后可直接用ESR檢測(cè)得到如圖所示譜線，結(jié)合已有文獻(xiàn)報(bào)道［8］，煙焦油中主要含有醌/半醌自由基和多環(huán)芳烴自由基，可由電子自旋共振條件公式hν=gβH計(jì)算分析，醌/半醌自由基飽和功率在2 mW，而多環(huán)芳烴自由基飽和功率在100 mW，我們?cè)?.02 mW功率下檢測(cè)到的ESR波譜中多環(huán)芳烴只占不到1%，主要為半醌類(lèi)自由基(QH·)［9－10］。

2.1.2 不同儲(chǔ)存期艾條產(chǎn)生煙氣自由基經(jīng)PBN捕集后獲得的圖譜 根據(jù)ESR波譜和超精細(xì)分裂常數(shù)，結(jié)合已有文獻(xiàn)報(bào)道，經(jīng)PBN捕集的煙氣自由基主要包括:烷氧自由基(RO·)和烷類(lèi)自由基(R·)［10］。

2.1.3 經(jīng)(DETC)2－Fe2+復(fù)合物捕集到的煙氣自由基圖譜 DETC首先與亞鐵離子結(jié)合生成(DETC)2－Fe2+復(fù)合物，然后與 NO反應(yīng)形成捕集復(fù)合物(DETC)2－Fe2+－NO，電子順磁共振檢測(cè)有三重峰特征譜線［11］。

圖2 不同儲(chǔ)存期艾條產(chǎn)生焦油自由基比較

圖3 PBN捕集到的煙氣自由基圖譜比較

圖4 (DETC)2－Fe2+復(fù)合物捕集到的煙氣自由基圖譜比較

2.1.4 半醌自由基再現(xiàn)反應(yīng)生成自由基信號(hào) 鄰苯二酚、對(duì)苯二酚和連苯三酚分別與氫氧化鈉溶液反應(yīng)，在1.02 mW功率下都可檢測(cè)到相同的自由基信號(hào)，以對(duì)苯二酚為例，文獻(xiàn)報(bào)道［10］，對(duì)苯二酚可在堿性條件下發(fā)生自氧化生成半醌自由基，這與我們得到的結(jié)果一致。

圖5 對(duì)苯二酚在堿性條件下產(chǎn)生的自由基ESR波譜

2.2 艾條燃燒產(chǎn)生自由基的相對(duì)含量 測(cè)量自由基ESR波譜各峰值信號(hào)強(qiáng)度的平均值，用以表示自由基的相對(duì)含量，不同儲(chǔ)存期艾條燃燒產(chǎn)生的焦油自由基及經(jīng)捕集得到的氣相自由基信號(hào)強(qiáng)度見(jiàn)表2。

結(jié)果測(cè)得儲(chǔ)存期為3年、5年的艾條燃燒產(chǎn)生醌/半醌自由基、烷類(lèi)和烷氧自由基以及NO自由基的信號(hào)強(qiáng)度都低于1年艾條(P＜0.05，P＜0.01)，而3年和5年艾條燃燒產(chǎn)生的醌/半醌自由基、烷類(lèi)和烷氧自由基信號(hào)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，5年艾條燃燒產(chǎn)生的NO自由基信號(hào)強(qiáng)度低于3年艾條(P＜0.01)。

表2 不同儲(chǔ)存期艾條產(chǎn)生自由基信號(hào)強(qiáng)度(s)

表2 不同儲(chǔ)存期艾條產(chǎn)生自由基信號(hào)強(qiáng)度(s)

注:與1年艾條比較，*P＜0.05;與1年艾條比較，＊＊P＜0.01;與3年艾條比較，△△P＜0.01。

儲(chǔ)存年份樣本量 焦油自由基 PBN捕集自由基 NO 自由基1年 5 9422.20±1114.22 9861.80±932.42 6205.60±4＊＊△△86.18 3年 5 7730.60±1207.52*8444.66±648.28* 4673.07±634.48＊＊5年 5 7500.80±1233.58* 8468.33±1004.02* 3474.40±336.08

3 討論

艾灸是中醫(yī)臨床常用的治療方法。古代醫(yī)家認(rèn)為艾灸臨床療效以陳艾為佳?！睹献印るx婁上》云:“猶七年之病，求三年之艾”。《本草綱目》載:“凡用艾葉，需用陳久者，治令細(xì)軟，謂之熟艾，若生艾灸火，則易傷人肌脈?！爆F(xiàn)代研究認(rèn)為:伴隨艾存儲(chǔ)時(shí)間的延長(zhǎng)，艾葉揮發(fā)油總量減少，揮發(fā)油中多數(shù)烯類(lèi)、部分醇類(lèi)與醛類(lèi)化合物的含量也逐漸降低，而各化合物相應(yīng)的醇、酮、酸等氧化產(chǎn)物的含量則逐漸增多［12］。陳艾揮發(fā)油減少使其燃燒更加緩慢柔和，并推測(cè)陳艾經(jīng)過(guò)幾年的存放，有害物質(zhì)揮發(fā)殆盡而安全性提高［13］。本研究中，儲(chǔ)存時(shí)間較長(zhǎng)的艾條(3年艾條、5年艾條)燃燒產(chǎn)生的焦油自由基和煙氣自由基比儲(chǔ)存時(shí)間較短的艾條(1年艾條)燃燒產(chǎn)生的自由基少。

自由基是具有未配對(duì)電子的原子、原子團(tuán)、分子或離子，可由共價(jià)鍵的熱分解、輻射分解和氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生。自然界中廣泛存在各類(lèi)自由基，自由基既可以繼續(xù)生成新自由基，又可以與其他自由基反應(yīng)變成惰性分子，實(shí)現(xiàn)自由基的湮滅。生物體內(nèi)的自由基一方面能產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化損傷、影響酶活性而對(duì)人體產(chǎn)生損害，另一方面也可以被人體利用從而參與ATP供能、殺傷病原微生物等一系列生理過(guò)程［14－15］。

煙焦油中含有醌/半醌自由基和多環(huán)芳烴自由基，我們采集后并經(jīng)過(guò)24 h晾干的艾煙焦油中仍可檢測(cè)到醌/半醌自由基信號(hào)，說(shuō)明焦油自由基性質(zhì)比較穩(wěn)定。已有的研究表明，艾葉中主要含揮發(fā)油、黃酮、鞣酸、三萜類(lèi)、烷烴類(lèi)成分等［16］。而對(duì)黃酮抗氧化作用機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，黃酮可以通過(guò)酚羥基與氧自由基反應(yīng)生成較穩(wěn)定的半醌式自由基，從而中止鏈?zhǔn)椒磻?yīng)［17］。半醌以穩(wěn)定的自由基負(fù)離子中間體形式存在，可被氧化成苯醌，又可以還原得到對(duì)苯二酚，而對(duì)苯二酚具有活潑羥基，O－H鍵能夠均裂生成半醌自由基［18－19］。艾燃燒生成物中也檢測(cè)出含有鄰苯二酚、對(duì)苯二酚、連苯三酚等物質(zhì)［3－4］。我們接下來(lái)運(yùn)用ESR波譜儀對(duì)鄰苯二酚、對(duì)苯二酚、連苯三酚在堿性條件下產(chǎn)生的自由基圖譜進(jìn)行了研究，當(dāng)檢測(cè)條件與焦油自由基相同時(shí)，可以檢測(cè)到典型的半醌自由基圖譜，見(jiàn)圖5。這和日本研究者發(fā)現(xiàn)艾煙在堿性環(huán)境下生成半醌自由基的報(bào)道相一致［20］。由此我們推斷，艾葉中黃酮、鞣酸等物質(zhì)在燃燒過(guò)程中裂解氧化，產(chǎn)生半醌自由基，并最終生成穩(wěn)定的酚類(lèi)物質(zhì)。通過(guò)相應(yīng)穩(wěn)定物質(zhì)如對(duì)苯二酚、鄰苯二酚、連苯三酚與堿作用可以再現(xiàn)得到半醌自由基，這一發(fā)現(xiàn)為我們進(jìn)一步檢測(cè)這些半醌自由基的生物活性奠定基礎(chǔ)。

氣相自由基不能用ESR波譜儀直接觀察，需要采用自旋捕集技術(shù)將不穩(wěn)定自由基捕捉后轉(zhuǎn)化成一種能用ESR波譜儀檢測(cè)的自旋加合物，這里用的自旋捕集劑PBN，對(duì)烷基自由基和烷氧自由基有特異捕捉能力，而(DETC)2－Fe2+復(fù)合物可以特異性的捕捉NO自由基。烷氧自由基的壽命極短(＜1 s)，可在煙氣流動(dòng)過(guò)程中生成，產(chǎn)生毒理學(xué)作用［21］。艾葉中揮發(fā)油與長(zhǎng)鏈烷烴成分在燃燒過(guò)程中可裂解生成烷基自由基，與氧氣發(fā)生過(guò)氧化生成烷氧自由基。NO是艾條燃燒過(guò)程中經(jīng)氧化產(chǎn)生的中間產(chǎn)物，為自由基結(jié)構(gòu)。通過(guò)NO產(chǎn)生烷基與烷氧基自由基，其反應(yīng)過(guò)程為［10］:

艾葉燃煙具有室內(nèi)空氣消毒的作用，古代用以防治瘟疫［22］，除了艾煙中的穩(wěn)定化學(xué)成分如揮發(fā)油［23］、酚類(lèi)具有滅菌作用，自由基與微生物之間更容易發(fā)生相互作用。同時(shí)，由于艾灸產(chǎn)生的焦油自由基半衰期長(zhǎng)，結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，有充分的時(shí)間進(jìn)入人體呼吸道，可能會(huì)導(dǎo)致基因誘變與細(xì)胞凋亡，是艾灸安全性的重要隱患。因此有必要對(duì)艾煙中自由基的生物活性和安全性做更深入的研究。

艾條燃燒生成自由基，我們檢測(cè)到焦油自由基以醌/半醌自由基(Q·/QH·)為主，煙氣自由基包括烷氧自由基(RO·)、烷類(lèi)自由基(R·)和NO自由基。儲(chǔ)存期3年和5年艾條燃燒生成的醌/半醌自由基、烷氧自由基(RO·)和烷類(lèi)自由基(R·)要少于1年艾條，從自由基可能存在的安全隱患考慮，儲(chǔ)存期為3年和5年的艾條安全性要優(yōu)于1年艾條。本研究成功由艾灸生成物中的酚類(lèi)物質(zhì)再現(xiàn)得到醌/半醌自由基，為進(jìn)一步研究艾灸生成物中自由基的生物活性提供了基礎(chǔ)。

(感謝中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所趙保路教授、張俊敬老師，中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所田秋老師對(duì)本研究提供的幫助。)

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