趙雪娜 王建清

(天津科技大學(xué)包裝與印刷工程學(xué)院，天津 300222)

赤擬谷盜［Tribolium castaneum(Herbst)］為世界性主要的儲(chǔ)糧和干貨類害蟲，尤其在高溫高濕情況下，極易發(fā)生蟲蛀危害。目前，主要采用磷化氫熏蒸防治，但長期過度使用導(dǎo)致其產(chǎn)生了不同程度的抗藥性［1］，而且也無法避免在之后的運(yùn)輸貯藏過程中的蟲害發(fā)生。近年來，植物精油對赤擬谷盜的活性研究在國內(nèi)外已有報(bào)道，具有忌避、熏蒸與觸殺作用［2－8］，它低毒、綠色;且由于精油的獨(dú)特作用機(jī)理，不易產(chǎn)生抗性，既能拓寬精油的用途，又能開創(chuàng)防蟲包裝的新途徑，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。

本研究提取了不同產(chǎn)地的4種花椒(Zanthoxylum bungeanum Maxim)精油，通過對赤擬谷盜蟲卵孵化的抑制作用研究，篩選出效果最好的精油，并對其殺蟲活性進(jìn)行了進(jìn)一步地研究，為開發(fā)新型無公害的殺蟲劑，研究防蟲包裝提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試蟲卵

赤擬谷盜，取自國家糧食局科學(xué)研究院，實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，即將赤擬谷盜成蟲接種于以全麥粉和酵母粉按質(zhì)量比為20∶1混合而成的飼料中，在(30±1)℃、相對濕度(75±5)%、24 h黑暗條件下進(jìn)行種群培養(yǎng)［9］，待成蟲大量出現(xiàn)時(shí)，每日篩出供試1日蟲卵。

篩卵方法:將小麥和酵母粉粉碎，過100目分選篩，配制比例為20∶1、粒徑小于0.15 mm 的飼料，調(diào)整水分13%左右;將成蟲接入飼料中，產(chǎn)卵24 h后，先過尼龍紗網(wǎng)，將成蟲篩去;取混有卵的飼料過80目篩，篩上留下的是卵和少量的飼料，篩下的飼料中無卵遺留，可重新飼養(yǎng)成蟲;將載有卵的少量飼料再過60目篩，分選篩上留下的即是1日齡卵(篩下的飼料去除，不再回收入成蟲飼料中)。

1.1.2 供試藥劑

東北青花椒、江津青花椒、漢源紅花椒、韓城紅花椒:安國市祁?yuàn)W中藥飲品有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 4種花椒精油的水蒸氣蒸餾提取

將花椒粉碎過篩，粒徑30目左右，裁出適當(dāng)大小的雙層紗布置于1 000 mL的加料瓶底部，然后將100 g花椒粉末用漏斗裝于紗布上。底部1 000 mL的三口燒瓶中裝入約為2/3容積的蒸餾水，加入適量的沸石，三口瓶的一側(cè)裝入安全管，另一側(cè)裝入傳感器(測溫度)。用加熱套加熱，鐵架臺固定，然后按圖1將水蒸氣蒸餾裝置組裝完成［10］。加熱套的溫度設(shè)定為110℃，蒸餾水沸騰后，揮發(fā)油測定器里開始有揮發(fā)油的油水混合物滴出，適時(shí)補(bǔ)充三口燒瓶中的蒸餾水，當(dāng)蒸餾出的精油不再增加時(shí)停止蒸餾。

將蒸餾液取出，用無水硫酸鈉去掉水分，即得花椒精油。前30 min每1 min記錄提取率，30～120 min每10 min記錄提取率，120～300 min每30 min記錄提取率。

圖1 新型的水蒸氣蒸餾裝置

1.2.2 4種花椒精油的GC－MS成分分析

采用氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC－MS)對提取的東北青花椒、江津青花椒、漢源紅花椒、韓城紅花椒精油的成分進(jìn)行分析。

色譜條件:柱子型號:VF －5ms，30 m ×0.25 mm×0.25 μm，進(jìn)樣口溫度300 ℃，分流比20，載氣 He，純度99.999%，柱流速1 mL/min;程序升溫:初始溫度60℃，以5℃/min升到200℃，以10℃/min升到300 min，保持 3 min。

質(zhì)譜條件:離子源:EI，質(zhì)量分析器:離子阱，阱溫:220℃，傳輸線溫度:280℃，掃描方式:全掃描，掃描范圍:50～1 000 m/z。

數(shù)據(jù)庫:利用NIST05標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫－計(jì)算機(jī)聯(lián)機(jī)檢索。

樣品的處理及測定:取4種精油用正己烷分別稀釋10 000倍，各取1μL進(jìn)樣。利用NBS75K標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫－計(jì)算機(jī)聯(lián)機(jī)檢索，與質(zhì)譜圖集的標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行對照、復(fù)合，再結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)，進(jìn)行人工譜圖解析，確認(rèn)4種精油的各個(gè)化學(xué)成分。按面積歸一化法進(jìn)行成分含量分析，分別計(jì)算各個(gè)成分的相對百分含量。

1.2.3 熏蒸試驗(yàn)

對傳統(tǒng)的成蟲三角瓶熏蒸法［11］進(jìn)行了改進(jìn)，以適用于蟲卵的熏蒸，具體熏蒸方法如下:在載玻片上貼附雙面膠用于固定蟲卵，用刀片劃分為4格，用毛筆將40粒卵輕輕撥入每格，即每個(gè)處理重復(fù)4次。將載有卵的載玻片置于250 mL三角瓶的底部，不同量的精油滴于尺寸為1 cm×4 cm的濾紙片上，濾紙片的一端固定在7層共擠薄膜的內(nèi)表面，使之懸空于三角瓶內(nèi)，用透明膠帶封合薄膜和三角瓶，保持熏蒸環(huán)境密閉。熏蒸48 h后將載有卵的載玻片取出，置于(30±2)℃、相對濕度(70±5)%環(huán)境下培養(yǎng)，記錄卵的最終孵化率。

1.2.4 觸殺試驗(yàn)

濾紙藥膜法［12］(直徑 90 mm，面積 63.5 cm2):用丙酮將精油配成不同濃度的溶液，取1 mL溶液加入到培養(yǎng)皿中的濾紙上，制成濾紙藥膜，待溶劑揮發(fā)后(1 h)，每皿接入40粒卵，每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)，處理24 h后取出，置于(30±2)℃、相對濕度(70±5)%環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)，記錄卵最終孵化率。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)處理采用了EXCEL統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

死亡率=死亡蟲數(shù)/供試蟲數(shù)×100%

采用Abbott公式對死亡率進(jìn)行校正:

校正死亡率=(處理死亡率－對照死亡率)/(1－對照死亡率)×100%［13］

用概率值法求出不同熏蒸處理時(shí)間和處理濃度下花椒精油的毒力回歸方程和LC50值［14］。

2 結(jié)果與分析

2.1 花椒品種對精油提取率的影響

水沸騰后開始計(jì)時(shí)，4種花椒精油的提取率隨時(shí)間的變化如圖2。從圖2可以看出，30 min內(nèi)4種花椒精油的提取率升高較快，30 min時(shí)東北青花椒、江津青花椒、漢源紅花椒、韓城紅花椒的提取率分別是5%、3.7%、4.6% 和 1.1%，過后提取率趨于平緩。180 min時(shí)東北青花椒的提取率達(dá)到最高為7.2%，240 min時(shí)江津青花椒的提取率達(dá)到最高為5.1%，180 min時(shí)漢源紅花椒的提取率達(dá)到最高為4.6%，120 min時(shí)韓城紅花椒的提取率達(dá)到最高為2.0%。因此為了節(jié)約成本，試驗(yàn)中采用120 min來提取花椒精油，也可應(yīng)用于工廠生產(chǎn)中。

圖2 4種花椒精油的提取率變化曲線

2.2 4種花椒精油的主要化學(xué)成分分析

圖3 4種花椒精油的總離子流圖

4種花椒精油的總離子圖譜如圖 3，利用NBS75K標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫－計(jì)算機(jī)聯(lián)機(jī)檢索，與質(zhì)譜圖集的標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行對照、復(fù)合，進(jìn)行人工譜圖解析，確認(rèn)精油的主要化學(xué)成分，按面積歸一化法進(jìn)行成分含量分析，分別計(jì)算各個(gè)成分的相對百分含量?？梢钥闯?，東北青花椒、江津青花椒和漢源紅花椒精油中含量最多的化學(xué)成分均是芳樟醇(出峰時(shí)間8.969 min)，相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 68.46%、58.01% 和48.23%，其次是檸檬烯(出峰時(shí)間 7.234 min)，相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 7.53%、9.96%和 19.66%，b －萜品烯(出峰時(shí)間 5.929 min)相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4.13%、8.73%和14.97%。韓城紅花椒精油中的各種化學(xué)成分含量都比較少，其中含量相對較高的是檸檬烯12.53%，其他含量比較多的成分包括(1R)－(+)－α蒎烯、b－萜品烯等，而芳樟醇僅占3.70%。芳樟醇和檸檬烯的分子結(jié)構(gòu)式如圖4。

圖4 芳樟醇和檸檬烯的分子結(jié)構(gòu)式

2.3 4種花椒精油對1日卵的熏蒸孵化抑制效果

4種花椒精油對1日卵熏蒸48 h后的校正死亡率如圖5所示，從圖5可以看出，隨著精油熏蒸濃度的升高，卵的孵化率越來越低，校正死亡率越來越高，兩種青花椒精油的效果要優(yōu)于兩種紅花椒精油，青花椒精油熏蒸濃度54μL/L時(shí)卵的校正死亡率已經(jīng)達(dá)到90%以上，其中東北青花椒精油對1日卵的孵化抑制效果是最佳的，致死率96.72%，而江津青花椒、漢源紅花椒和韓城紅花椒精油處理后，卵的校正死亡率分別為92.43%、88%和70.49%。

圖5 4種花椒精油對赤擬谷盜蟲卵熏蒸48 h后的毒力作用

4種花椒精油的熏蒸毒力回歸方程和致死中濃度 LC50如表1，東北青花椒的 LC50是29.28 μL/L，明顯低于其他3種花椒精油，對卵的孵化抑制效果最好，而韓城紅花椒精油的殺蟲效果最差。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，青椒精油對赤擬谷盜成蟲和米象成蟲的熏蒸效果優(yōu)于紅椒精油，且2種花椒精油的持續(xù)期長，在高溫下能更好地發(fā)揮藥效［15－16］。

表1 4種花椒精油對赤擬谷盜蟲卵的熏蒸毒力(48 h)

空白對照組和熏蒸處理組的蟲卵孵化如圖6(放大1 000倍)?？瞻讓φ战M的蟲卵正常孵化，在顯微鏡下可以清晰地看到破裂的卵殼和孵化出的幼蟲，隨著精油熏蒸濃度的升高，孵化率隨之下降，當(dāng)精油熏蒸濃度提高到42μL/L時(shí)，卵內(nèi)細(xì)胞質(zhì)開始皺縮，54μL/L精油處理后，細(xì)胞質(zhì)皺縮率達(dá)到50%左右，卵無法孵化。

圖6 東北青花椒精油熏蒸處理后的蟲卵

2.4 4種花椒精油對1日卵的觸殺試驗(yàn)

4種花椒精油對1日卵進(jìn)行觸殺試驗(yàn)后的校正死亡率如圖7所示。從圖7可以看出，隨著精油觸殺用量的升高，卵受到精油的致死影響，孵化率越來越低，校正死亡率越來越高。每個(gè)用量下東北青花椒精油的致死效果都是最好的，江津青花椒和漢源紅花椒效果相近，而韓城紅花椒在低用量時(shí)觸殺效果較差。當(dāng)東北青花椒精油觸殺用量3.6μL/cm2時(shí)，對1日卵孵化的抑制率高達(dá)97.85%。另外3種花椒精油校正死亡率為85.71%、86.44%和85.23%，還未完全抑制卵的孵化繁殖。

圖7 4種花椒精油對赤擬谷盜蟲卵的觸殺毒力作用

4種花椒精油的觸殺毒力回歸方程和致死中量LD50如表2，東北青花椒的 LD50是1.02 μL/cm2，明顯低于其他3種花椒精油，殺蟲效力最佳。與熏蒸毒力效果類似，韓城紅花椒的毒力效果較差。

表2 4種花椒精油對赤擬谷盜蟲卵的觸殺毒力

綜合熏蒸試驗(yàn)結(jié)果和觸殺試驗(yàn)結(jié)果，選定東北青花椒精油進(jìn)行后續(xù)研究，探索其對赤擬谷盜蟲卵的毒力效果。通過GC－MS分析結(jié)果看，東北青花椒精油中芳樟醇含量最高，江津青花椒和漢源紅花椒精油次之，韓城紅花椒精油最少，從殺卵效果來看，前3者也較好，而韓城紅花椒精油效果最差。另外，雖然后3者的檸檬烯含量較高，但是殺蟲效果卻次于東北青花椒精油。由此可以看出花椒精油中芳樟醇對赤擬谷盜蟲卵的孵化抑制效果是最明顯的，是殺卵的主要成分。這與路春明等［4］的研究成果類似。

2.5 在不同熏蒸時(shí)間下，東北青花椒精油熏蒸濃度對赤擬谷盜蟲卵熏蒸毒力的影響

東北青花椒精油熏蒸24 h的熏蒸濃度設(shè)定為30、36、42、48、54、60、66 μL/L，熏蒸 48 h 的熏蒸濃度設(shè)定為18、24、30、36、42、48、54 μL/L，熏蒸72 h 的熏蒸濃度設(shè)定為 6、12、18 、24、30、36、42 μL/L，如圖 8，精油熏蒸濃度為54μL/L時(shí)，熏蒸24 h后使得蟲卵的校正死亡率達(dá)到了94%，48μL/L時(shí)熏蒸48 h后校正死亡率達(dá)到91%，差別不是特別大，但是當(dāng)熏蒸時(shí)間達(dá)到72 h后，36μL/L的精油熏蒸濃度可以達(dá)到95%的致死率，殺蟲效力大大增加，也就是隨著精油熏蒸濃度的增加，較短的時(shí)間就可以達(dá)到較高的致死效果。

圖8 東北青花椒精油熏蒸濃度對赤擬谷盜蟲卵的毒力影響

東北青花椒精油的熏蒸毒力回歸方程和致死中濃度LC50如表3。隨著時(shí)間的延長，LC50值逐漸減小，并且熏蒸72 h與48 h和24 h的LC50差別比較大，熏蒸活性增幅明顯，說明精油效果具有較長的持續(xù)期，熏蒸時(shí)間越長效果越好，因此，適當(dāng)延長熏蒸時(shí)間可以減少用藥量。

表3 東北青花椒精油熏蒸時(shí)間對赤擬谷盜蟲卵的毒力

2.6 在不同熏蒸濃度下，東北青花椒精油熏蒸時(shí)間對赤擬谷盜蟲卵熏蒸毒力的影響

2.6.1 東北青花椒精油對1日卵熏蒸試驗(yàn)

用20、30、40、50 μL/L 的精油對1 日卵進(jìn)行 12、18、24、36、42、48、60、72 h 的熏蒸，確定其校正死亡率達(dá)到50%的時(shí)間段。如圖9，在熏蒸濃度為20 μL/L時(shí)，熏蒸72 h后的校正死亡率為45.38%，還沒有達(dá)到50%的致死率，可以去除這個(gè)濃度。熏蒸濃度為30μL/L時(shí)，在42～60 h中，校正死亡率由45.86%升至 63.91%;熏蒸濃度為 40 μL/L時(shí)，在18 ～36 h中，校正死亡率由 40.77%升至 56.92%;熏蒸濃度為50μL/L時(shí)，熏蒸18 h后，校正死亡率達(dá)到60.90%。因此，選定精油熏蒸濃度為30、40和50 μL/L，熏蒸時(shí)間段分別為42～60 h、18～36 h和1～19 h進(jìn)行致死中時(shí)間LT50的測定。

圖9 東北青花椒精油熏蒸時(shí)間對赤擬谷盜蟲卵的毒力影響

2.6.2 東北青花椒精油對1日卵熏蒸致死中時(shí)間LT50的測定

3種濃度的精油對1日卵進(jìn)行熏蒸處理，精油熏蒸濃度為 30 μL/L 時(shí)分別熏蒸 42、44、46、48、50、52、54、56、58、60 h;40 μL/L 時(shí)分別熏蒸 18、20、22、24、26、28、30、32、34、36 h;50 μL/L 時(shí)分別熏蒸 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19 h;通過對不同濃度的東北青花椒精油的熏蒸毒力進(jìn)行回歸分析，結(jié)果如表4。熏蒸濃度為30μL/L的LT50為45.11 h，40 μL/L的 LT50為 29.41 h，50 μL/L 的 LT50為12.98 h，因此東北青花椒精油熏蒸濃度和赤擬谷盜蟲卵的活性有密切的關(guān)系，可以根據(jù)實(shí)際需要，選擇合適的熏蒸濃度和熏蒸時(shí)間，達(dá)到較好的熏蒸效果。

表4 東北青花椒精油熏蒸濃度對赤擬谷盜蟲卵的毒力

3 結(jié)論

從研究結(jié)果可以看出，花椒精油的提取率比較高，工業(yè)生產(chǎn)中可以提取120 min以節(jié)約成本。4種花椒精油對赤擬谷盜蟲卵的孵化具有較好的抑制作用，尤其是東北青花椒精油的效果更佳，提取率更高。試驗(yàn)在250 mL空三角瓶中研究了東北青花椒精油對赤擬谷盜1日卵的熏蒸效果，熏蒸24、48和72 h 的 LC50分別為 34.82、29.28 和 16.48 μL/L，熏蒸時(shí)間越長，所需的精油濃度依次降低。精油熏蒸濃度分別為30、40和50μL/L時(shí)致死中時(shí)間LT50分別為45.11、29.41 和 12.98 h。精油熏蒸濃度越高，達(dá)到抑制效果的時(shí)間越短，這對于之后在儲(chǔ)糧或干貨防蟲方面的實(shí)際應(yīng)用提供了指導(dǎo)意義。國內(nèi)外針對赤擬谷盜的研究主要涉及幼蟲和成蟲方面的研究，對赤擬谷盜蟲卵的研究較少，植物精油對于蟲卵的效果相對較差，但作為儲(chǔ)糧防蟲以及防蟲包裝方面，需要從蟲卵態(tài)開始進(jìn)行抑制，因此本研究改進(jìn)了蟲卵的熏蒸方法，為植物精油在蟲卵熏蒸方面的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

針對本研究結(jié)果，今后需要繼續(xù)深入研究的問題主要有實(shí)倉中精油的滲透力、應(yīng)用對象對精油的吸附、溫度等的影響對花椒精油熏蒸濃度和熏蒸時(shí)間的影響，并探索應(yīng)用于防蟲包裝中，代替目前的化學(xué)熏蒸劑，提高植物殺蟲劑的應(yīng)用實(shí)踐價(jià)值。

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