王 霏 倪 中華 陳 云飛 劉 磊 馬 建 畢 晨

(東南大學(xué)江蘇省微納生物醫(yī)療器械設(shè)計(jì)與制造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 211189)

納通道內(nèi)λ-DNA過孔信號的小波去噪及統(tǒng)計(jì)分析

王 霏 倪 中華 陳 云飛 劉 磊 馬 建 畢 晨

(東南大學(xué)江蘇省微納生物醫(yī)療器械設(shè)計(jì)與制造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 211189)

針對λ噬菌體中的脫氧核糖核酸(λ-DNA)通過納米通道時(shí)的過孔信號噪音大，強(qiáng)度弱且非平穩(wěn)的缺點(diǎn)，提出了使用具有良好時(shí)頻域分辨能力的小波分析方法對其進(jìn)行去噪處理，并對有效去噪后的λ-DNA過孔信號進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析.首先根據(jù)小波去噪原理，選擇合適的小波函數(shù)，確定最佳的分解層數(shù)并選取合適的閾值，對實(shí)驗(yàn)采集到的含噪聲信號進(jìn)行去噪處理.根據(jù)最終去噪效果可得，以sym7為小波基函數(shù)、分解層數(shù)5層、使用默認(rèn)軟閾值可以有效降低信號中的噪聲，提高信噪比.然后，對具有48 000個(gè)堿基對(48 kbp)的λ-DNA通過60 nm氮化硅(SiN)納米孔的特征信號進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，分析結(jié)果表明，阻塞電流和過孔時(shí)間分別符合雙峰高斯分布和偏正態(tài)分布，這為后續(xù)DNA分子的辨識工作提供了依據(jù).

納米通道;λ-DNA過孔信號;小波去噪;信噪比;統(tǒng)計(jì)分析

利用納米通道(nanopores)研究DNA等生物大分子的結(jié)構(gòu)是一種嶄新的生物技術(shù)［1］，而對納米通道內(nèi)的檢測信號進(jìn)行分析是研究生物大分子結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ).作為基于微納制造的第三代基因測序系統(tǒng)中基礎(chǔ)理論研究工作的一部分，本文采用膜片鉗記錄nA級甚至pA級［2］的λ-DNA通過氮化硅納米孔的離子電流信號，由于有效信號相對于噪聲信號很微弱，分析的準(zhǔn)確度較低，因此需要對檢測到的λ-DNA信號先去噪再分析.

信號處理中常用的去噪方法包括Fourier分析、短時(shí) Fourier變換、Wigner-Ville 分布等［3］，其中基于Fourier分析的方法只能使用在信號和噪聲頻帶重疊部分非常小或者完全分開的情況下，對于納通道內(nèi)微弱、非平穩(wěn)信號，F(xiàn)ourier分析方法有一定的局限性.小波分析是一種時(shí)間窗和頻率窗都可以改變的時(shí)頻局域化分析方法，即在低頻部分具有較高的頻率分辨率和較低的時(shí)間分辨率，在高頻部分具有較高的時(shí)間分辨率和較低的頻率分辨率［4］.信號和噪聲在小波變換下表現(xiàn)出截然不同的性質(zhì)，它能更準(zhǔn)確地得到信號上特定點(diǎn)的奇異性信息［5］.

目前國內(nèi)外關(guān)于納通道λ-DNA檢測信號去噪的研究，主要是根據(jù)噪音產(chǎn)生機(jī)理在實(shí)驗(yàn)過程中進(jìn)行去噪.在氮化硅膜片上涂PDMS可以有效降低高頻噪音，實(shí)驗(yàn)前用水虎魚溶液對納米通道進(jìn)行表面化學(xué)處理可以有效降低低頻噪音［6］.鄭華等［7］在對電泳熒光信號去噪時(shí)使用了小波分析的方法，季忠等［8］也運(yùn)用小波變換對微弱非平穩(wěn)腦電信號成功去噪.

本文根據(jù)實(shí)驗(yàn)信號的特點(diǎn)，采用小波去噪的方法，去除λ-DNA微弱電信號中的噪聲信號，獲取有效的二次數(shù)據(jù)，為準(zhǔn)確識別其分子結(jié)構(gòu)提供可靠的數(shù)據(jù).小波去噪處理后，根據(jù)λ-DNA在納米通道輸運(yùn)過程中微弱電流脈沖信號的變化，即信號的駐留時(shí)間和幅度，對過孔信號的阻塞電流(Ib)以及過孔時(shí)間(td)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，為今后DNA分子測序中的信號分析以及大分子辨識工作奠定基礎(chǔ).

1 小波去噪

1.1 原理

小波變換是Fourier變換思想的發(fā)展與延拓.Mallat算法利用小波變換將信號分解成不同的頻段成分，信號C經(jīng)過離散小波分解可獲得在不同尺度下的帶通項(xiàng)，如圖1所示.其中，Di(i=1，2，…，n)為信號中的高頻部分，稱作細(xì)節(jié)信號，分解次數(shù)越多，高頻的成分越少.Ai(i=1，2，…，n)為信號中的低頻部分，稱作近似信號.

實(shí)際應(yīng)用中，有用信號通常表現(xiàn)為低頻的或者一些比較平穩(wěn)的信號，而噪聲則通常表現(xiàn)為高頻的或者一些非平穩(wěn)的信號.對小波分解后的高頻部分進(jìn)行去噪處理，再將信號重構(gòu)，得到需要去噪后的信號，一般過程如下:

圖1 小波分解示意圖

1)信號的小波分解.選擇確定的小波基函數(shù)和小波分解層數(shù)N，對信號進(jìn)行N層小波分解.

2)高頻系數(shù)的閾值量化.選擇一個(gè)閾值量化準(zhǔn)則，對每一個(gè)分解層次中的高頻系數(shù)進(jìn)行閾值量化處理.

3)小波重構(gòu).根據(jù)閾值量化后的第1層～第N層的高頻系數(shù)和第N層的低頻系數(shù)進(jìn)行小波逆變換，重構(gòu)去噪后的信號.

1.2 效果判定

信噪比(SNR)和最小均方誤差(MSE)是判斷去噪效果的依據(jù).信噪比越大，均方誤差越小，去噪效果越好.要得到理想的去噪效果，需要選擇合適的小波基函數(shù)，確定最佳的分解層數(shù)并選取合適的閾值.對某一信噪比的含噪聲信號，分別改變所取的小波基函數(shù)、分解層數(shù)和閾值取法，通過大量的對比仿真實(shí)驗(yàn)找到最好的去噪方法.然后再對不同信噪比的含噪聲信號進(jìn)行去噪處理.

1)信噪比SNR

2)均方誤差MSE

式中為原始信號的功率;為原始信號中噪聲的功率;f(n)為原始信號;(n)為去噪后的信號.

1.3 λ-DNA實(shí)驗(yàn)信號去噪

圖2為λ-DNA在氯化鉀溶液中通過60 nm氮化硅納米孔時(shí)用膜片鉗記錄的離子電流信號.采樣頻率為 50 kHz，采樣點(diǎn)數(shù)為 2.5 ×105.

1.3.1 小波基函數(shù)的確定

由于小波分析中的小波基函數(shù)具有多樣性，在λ-DNA電流信號去噪過程中，主要從經(jīng)過小波變換處理后所獲得信號曲線不失真的角度來選擇小波基函數(shù).

圖2 λ-DNA通過氮化硅納米孔的電流信號

通過在Matlab7.1中對納通道內(nèi)的過孔信號進(jìn)行仿真，發(fā)現(xiàn)采用symN和dbN函數(shù)進(jìn)行小波去噪處理后，信號的峰形良好，且這2種小波基函數(shù)的性質(zhì)也較好.因此，本文采用信噪比和最小均方誤差來確定最佳小波基函數(shù).

對實(shí)驗(yàn)信號在默認(rèn)軟閾值下進(jìn)行5層分解，比較不同小波基函數(shù)的去噪效果(見表1).由表可知，對λ-DNA電流信號，sym7小波基函數(shù)的信噪比最高，均方誤差最小，所以sym7為最佳小波基函數(shù).

表1 使用不同小波基函數(shù)的去噪效果

1.3.2 分解層數(shù)的確定

分解層數(shù)是決定去噪效果的重要因素，需要根據(jù)實(shí)際信號的特點(diǎn)確定.本文中，將信號分解層數(shù)設(shè)置為1～8.比較不同分解層數(shù)去噪后的效果，結(jié)果見圖3.可以明顯看出，分解層數(shù)越多，去噪效果越好;但分解層數(shù)超過5層后，改善效果不是太明顯，且信號會出現(xiàn)失真.所以本文確定分解層數(shù)為5層.

圖3 不同分解層數(shù)L的去噪效果圖

1.3.3 閾值的選取

噪聲是一種隨機(jī)信號，其方差是未知的，首先要對其閾值進(jìn)行估計(jì).經(jīng)過小波分解后，信號的系數(shù)要大于噪聲的系數(shù)，但可以找到一個(gè)合適的數(shù)值作為閾值.當(dāng)分解系數(shù)小于該臨界閾值時(shí)，認(rèn)為主要是由噪聲引起的，因此可將噪聲截掉;當(dāng)分解系數(shù)大于該臨界閾值時(shí)，認(rèn)為主要是由信號引起的，可以保留該分解系數(shù).

表2為3種不同閾值量化處理方法的信噪比和均方誤差.由表可知，使用各層不同閾值去噪，雖然消噪效果最明顯，但峰高誤差較大，信號失真較嚴(yán)重，所以最后確定使用默認(rèn)閾值消噪為λ-DNA消噪的閾值量化處理方法，去噪前后信號對比見圖4.

表2 3種不同閾值選取方法的消噪效果

本文針對λ-DNA在氯化鉀溶液中通過納米孔時(shí)產(chǎn)生的電流信號的特點(diǎn)，對小波基函數(shù)、分解層數(shù)和閾值進(jìn)行了研究.結(jié)果表明，選擇sym7為小波基函數(shù)，分解層數(shù)為5層，使用默認(rèn)軟閾值，去噪處理后，信噪比提高，峰高誤差較小，便于開展后續(xù)的信號分析工作.

圖4 默認(rèn)閾值消噪效果圖

2 信號統(tǒng)計(jì)分析

從圖2的實(shí)驗(yàn)信號中可以看出，電流幅度有一系列的下降，這是由于單個(gè)λ-DNA分子在電場力的作用下穿過納米通道時(shí)會形成阻塞，導(dǎo)致通道內(nèi)離子電流減小.由于核酸鏈上各堿基尺寸和分子結(jié)構(gòu)的差異，在穿孔過程中對孔的阻塞程度也不同，因此在一定實(shí)驗(yàn)條件下，通過分析阻塞電流Ib和過孔時(shí)間td來監(jiān)測電流信號的變化，能夠推測出生物大分子的化學(xué)組成、空間結(jié)構(gòu)等特性.

圖5為λ-DNA(48 kbp)在1 V電壓下通過60 nm的SiN納米通道時(shí)，拉直狀態(tài)(nonfolded)、半折疊狀態(tài)(partially folded)、折疊狀態(tài)(fully folded)3種類型特征事件的信號［9］，分別表示λ-DNA分子以不同姿態(tài)通過納米通道.由于納米孔厚度相對于λ-DNA分子長度要小很多，故過孔時(shí)間只考慮λ-DNA的長度.理論上拉直狀態(tài)的λ-DNA過孔時(shí)，物理占位較小，由此引起的電流降也較小，同時(shí)，由于拉直狀態(tài)的λ-DNA長度較長，因此過孔時(shí)間也會相應(yīng)較長;同理，折疊狀態(tài)的λ-DNA引起的電流降幅度較大，且過孔時(shí)間變短;半折疊狀態(tài)的λ-DNA的電流降和過孔時(shí)間均應(yīng)該位于前兩者之間.從圖5(a)的半折疊狀態(tài)信號形態(tài)可以看出，信號明顯有2個(gè)電流降水平(虛線處)，這證明了DNA通過納米通道時(shí)先是折疊狀態(tài)后是拉直狀態(tài)，由此可以判斷此類信號為DNA半折疊狀態(tài)的過孔信號.

圖5 λ-DNA(48 kbp)通過60 nm SiN納米通道電流信號統(tǒng)計(jì)分析

從大量事件中對阻塞電流和過孔時(shí)間進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，得到的阻塞電流Ib的統(tǒng)計(jì)直方圖(見圖5(c))、過孔時(shí)間td的統(tǒng)計(jì)直方圖(見圖5(d))以及特征事件的阻塞電流對過孔時(shí)間的散點(diǎn)分布圖(見圖5(b)).由于半折疊狀態(tài)的事件發(fā)生概率很低，數(shù)目較少，不易統(tǒng)計(jì)得到分布規(guī)律，故本文重點(diǎn)統(tǒng)計(jì)分析了其余2類事件.圖5(b)中的每個(gè)散點(diǎn)表示一個(gè)λ-DNA過孔事件，由此可以看出拉直和折疊2種狀態(tài)的過孔信號Ib和td分布，從而可以計(jì)算得到其平均阻塞電流分別為(1.237 1±0.226 3)nA和(2.140 9±0.352 1)nA;平均過孔時(shí)間分別為(0.497 1±0.251 2)ms和(0.376 6±0.226 5)ms.

對直方圖的高斯擬合可以反映統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)的實(shí)驗(yàn)意義［10］.圖5(c)為Ib統(tǒng)計(jì)直方圖，圖中的雙峰分別表示了拉直和折疊2個(gè)狀態(tài)的過孔信號.對其進(jìn)行雙峰高斯擬合，結(jié)果證明這2種信號的阻塞電流各自符合高斯分布.圖5(d)為td的統(tǒng)計(jì)直方圖，由于2種信號的過孔時(shí)間差異在0.1 ms左右，因此沒有明顯的雙峰，整體符合偏正態(tài)分布.

阻塞電流包含了大分子的尺寸和結(jié)構(gòu)信息，而過孔時(shí)間反應(yīng)了大分子在納米通道內(nèi)運(yùn)動的快慢，過孔時(shí)間越長采集到的大分子信息越多，更容易大分子辨識工作［11］.

3 結(jié)語

本文提出了采用小波去噪的方法消除納通道中微弱電信號中的噪聲，并對膜片鉗采集的48 kbp λ-DNA通過60 nm SiN納米孔的含噪聲信號進(jìn)行去噪處理，確定了合適的小波基函數(shù)、最佳的分解層數(shù)和合適的閾值.對去噪后的信號進(jìn)行分析，分辨出3種不同狀態(tài)的過孔信號，并對拉直狀態(tài)和折疊狀態(tài)的λ-DNA信號進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)和擬合，得到其阻塞電流和平均過孔時(shí)間的分布圖.

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Wavelet denoising and statistical analysis of signal of λ-DNA translocation through nanopores

Wang Fei Ni Zhonghua Chen Yunfei Liu Lei Ma Jian Bi Chen

(Jiangsu Key Laboratory for Design and Manufacture of Micro-Nano Biomedical Instruments，Southeast University，Nanjing 211189，China)

To overcome the shortcomings that the signal of λ-DNA translocation through nanopores has high-noise，weak-strength and non-stationary，a wavelet analysis method with excellent resolution capabilities in time and frequency domain is proposed to analyze the signal of λ-DNA translocation.A statistical analysis is applied to the λ-DNA signal after effective denoising.First，according to the principle，suitable wavelet base function and the best decomposition level are chosen，and the denoising threshold is determined.The results indicate that by using sym7 wavelet base function，decomposition level at 5 and using default soft threshold the noise in the signal can be reduced effectively and the signal to noise ratio(SNR)can be improved.And then，the characteristic current signals，which arise from λ-DNA molecules of 48 kbp translocating through silicon nitride nanopores of 60 nm are statistically analyzed.The analysis results show that the current blockade and translocation time correspond to bimodal and skewed normal distribution respectively，which provides basis for subsequent DNA molecular identification.

nanopores;signal of λ-DNA translocation;wavelet denoising;signal to noise ratio;statistical analysis

TH776

A

1001－0505(2013)01-0050-05

10.3969/j.issn.1001－0505.2013.01.010

2012-05-12.

王霏(1986—)，女，碩士生;倪中華(聯(lián)系人)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，nzh2003@seu.edu.cn.

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)資助項(xiàng)目(2011CB707601，2011CB707605).

王霏，倪中華，陳云飛，等.納通道內(nèi)λ-DNA過孔信號的小波去噪及統(tǒng)計(jì)分析［J］.東南大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2013，43(1):50－54.［doi:10.3969/j.issn.1001－0505.2013.01.010］