于曉敏 郝祥俊 龔明玉 (承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000)

心肌缺血再灌注(IR)損傷后發(fā)生的嚴(yán)重心律失常是阻礙缺血心肌從再灌注療法中獲得最佳療效的主要原因，大大削弱了再通的意義〔1，2〕，其發(fā)生機(jī)制主要與再灌注后細(xì)胞內(nèi)鈣超載、氧自由基大量生成、誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡等有關(guān)〔3〕。黃芩莖葉總黃酮(SSTF)為黃芩莖葉的提取物，其主要成分為黃酮類化合物，具有抗氧化及改善心腦血管的供血等廣泛的藥理活性〔4，5〕。但SSTF對缺血再灌注后心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制，少有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)建立大鼠心肌IR模型，旨在研究SSTF在損傷中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 SSTF純度為61.8%，是黃芩莖葉的提取物，其主要成分為黃酮類化合物，為唇形科植物。批號(hào)010608，由本院省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-中藥研究所提供，用飽和NaHCO3溶解配制后灌胃。AnnexinⅤ-EGFP凋亡試劑盒(南京凱基生物科技有限公司)。STAT1，STAT3兔抗鼠多克隆抗體(美國Santa公司)。

1.1.2 動(dòng)物 健康SD大鼠40只，體重(220±20)g，雌雄各半。購自天津市山川紅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，許可證號(hào)scxk津2009-001。

1.1.3 主要儀器 DB-3型心電圖機(jī)，上海光電醫(yī)用電子儀器有限公司:DW-2000型動(dòng)物人工呼吸機(jī)，上海嘉鵬科技有限公司:FACSCalibur流式細(xì)胞儀，美國B＆D公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組及處理 40只SD大鼠隨機(jī)分為5組:假手術(shù)組(sham組)、缺血再灌注組(IR組)、SSTFⅠ組 、SSTFⅡ組、SSTFⅢ組，每組8只。4組大鼠均制備心肌IR模型，其中3個(gè)SSTF組大鼠于手術(shù)前1 w分別灌服不同劑量的SSTF(17.5、35、70 mg·kg-1·d-1)，連用 7 d;sham 組和 IR 組術(shù)前分別給予相應(yīng)容積的生理鹽水，時(shí)間同SSTF組。

1.2.2 心肌缺血再灌注模型的制備 10%烏拉坦腹腔注射麻醉(1 ml/100 g)大鼠，仰臥位固定，用針型電極插入大鼠四肢皮下記錄標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖。于胸骨左緣3～4肋間切開胸壁，暴露心臟，在左心耳與肺動(dòng)脈干之間結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，同時(shí)在結(jié)扎線與血管之間穿一直徑2 mm，長5 mm的硅膠管，結(jié)扎30 min;然后剪斷縫合線，取出硅膠管，再灌注2 h，假手術(shù)組僅分離前降支，但不結(jié)扎。

1.2.3 Annexinv/PI雙染，流式細(xì)胞儀檢測心肌細(xì)胞凋亡情況 再灌注后取梗死區(qū)邊緣心肌組織5 mm3，機(jī)械法制備單細(xì)胞懸液，經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過濾。取1 ml細(xì)胞，1 500 r/min 4℃離心5min，收集細(xì)胞。加入1 ml冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次。將細(xì)胞重懸于500 μl上樣緩沖液，加入5 μl Annexin V-EGFP和5 μl PI，輕輕混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，上機(jī)檢測，計(jì)算凋亡心肌細(xì)胞百分比。結(jié)果判定:AnnexinⅤ-/PI-為正常細(xì)胞，AnnexinⅤ+/PI-為凋亡細(xì)胞，AnnexinⅤ +/PI+為壞死細(xì)胞。

1.2.3 SP免疫組化檢測STAT1及STAT3蛋白的表達(dá) 取大鼠心肌組織，置于10%中性甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，將切片用3%H2O2室溫孵育10 min消除內(nèi)源性過氧化氫酶的活性，PBS洗5 min×3;置于0.01%枸櫞酸鹽緩沖液中，微波爐抗原修復(fù);PBS洗5 min×3，滴加非免疫血清封閉液，室溫孵育20 min;傾去血清后分別滴加STAT1(1∶200)及STAT3(1∶100)的一抗，于4℃下過夜;PBS洗5 min×3，滴加生物素標(biāo)記二抗，室溫下1 h;PBS洗5 min×3，滴加HRP-SA，于室溫下放置1 h;PBS洗5 min×3，滴加DAB進(jìn)行顯色;蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明、封片。常規(guī)設(shè)立陰性對照。結(jié)果判定:陽性信號(hào)呈棕黃色顆粒，STAT1及STAT3蛋白表達(dá)于胞漿和胞核。定量分析:在光學(xué)顯微鏡400倍視野下，每張切片隨機(jī)選取陽性細(xì)胞分布均勻的5個(gè)視野，計(jì)數(shù)著色細(xì)胞占視野細(xì)胞總數(shù)的百分?jǐn)?shù)，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞儀檢測Annexinv-EGFP標(biāo)記的心肌細(xì)胞凋亡情況 與sham組相比，IR組細(xì)胞凋亡率明顯增加(12.45%±2.17%vs 6.78% ±0.96%，P＜0.01);與 IR組相比，Ⅰ、Ⅱ、ⅢSSTF組細(xì)胞凋亡率均明顯降低(10.32% ±2.04%，9.44% ±1.85%，7.96% ±1.23%，P＜0.05，P＜0.01)，提示 SSTF可減輕缺血再灌注誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞凋亡。

2.2 SP免疫組化檢測STAT1及STAT3蛋白的表達(dá)情況 與sham組比較，IR組STAT1蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞率明顯升高(P＜0.01)，但STAT3蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞率明顯降低(P＜0.01);與IR組相比，SSTFⅡ組和SSTFⅢ組STAT1蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞率明顯降低(P＜0.05，P＜0.01);但SSTFⅠ組、SSTFⅡ組和SSTFⅢ組STAT3蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞率明顯升高(P＜0.05，P＜0.01)，說明IR增加STAT1蛋白表達(dá)，減少STAT3蛋白表達(dá);SSTF下調(diào)STAT1蛋白表達(dá)，上調(diào)STAT3蛋白表達(dá)。見表2及圖 1，圖 2。

表2 SSTF對大鼠缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因JAK2蛋白表達(dá)的影響(n=8，±s)

表2 SSTF對大鼠缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因JAK2蛋白表達(dá)的影響(n=8，±s)

與sham組比較:1)P＜0.01;與IR組比較:2)P＜0.05，3)P＜0.01

組別 濃度(mg·kg-1·d-1)STAT1陽性細(xì)胞率 STAT3陽性細(xì)胞率sham - 0.084±0.05 0.276±0.09 IR - 0.257±0.09 0.074±0.04 SSTFⅠ 17.5 0.211±0.07 0.185±0.062)SSTFⅡ 35 0.168±0.042) 0.193±0.082)SSTFⅢ 70 0.117±0.063) 0.237±0.101)

3 討論

近年來，心血管疾病已經(jīng)成為危害人類健康的主要?dú)⑹?，而很多因素造成了心肌和血管的損害〔6〕。IR可加重心肌損傷，是心臟手術(shù)，體外循環(huán)常見的一種病理生理變化，可造成多種不良的臨床后果，如心肌梗死、心力衰竭等。心肌細(xì)胞死亡的形式有壞死和凋亡兩種，近期研究認(rèn)為細(xì)胞凋亡是心肌IR損傷的特征之一〔7～9〕，抑制IR所引起的心肌細(xì)胞凋亡有助于減小心肌梗死面積，改善心功能〔10〕。細(xì)胞凋亡是生物體生命過程中不可缺少的組成部分，貫穿于整個(gè)生命活動(dòng)中。

本實(shí)驗(yàn)證明IR可引起細(xì)胞凋亡，而SSTF可抑制IR引起的細(xì)胞凋亡而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，JAK/STAT信號(hào)通路與心臟疾病發(fā)生的相關(guān)病理機(jī)制關(guān)系密切，其涉及心肌細(xì)胞的生長、存活和凋亡，在心臟疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用〔11〕。JAK/STAT信號(hào)通路與缺血再灌注損傷有一定關(guān)系。在哺乳動(dòng)物JAKs家族中已發(fā)現(xiàn)4種激酶，即 JAK1、JAK2、JAK3和 Tyk2。STATs作為JAKs的靶蛋白，是存在于胞質(zhì)中的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族，有7種STAT 蛋白，即 STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6。STAT1和STAT3與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，STAT1是細(xì)胞凋亡促進(jìn)因子，STAT3是細(xì)胞凋亡抑制因子。本實(shí)驗(yàn)說明IR增加STAT1蛋白表達(dá)，減少STAT3蛋白表達(dá);SSTF下調(diào)STAT1蛋白表達(dá)，上調(diào)STAT3蛋白表達(dá)。

綜上所述，SSTF可直接作用于心肌細(xì)胞，減輕心肌IR損傷，且其心肌保護(hù)效應(yīng)在一定劑量范圍內(nèi)隨劑量增加而增加，其保護(hù)機(jī)制可能通過下調(diào)STAT1蛋白表達(dá)，上調(diào)STAT3蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。

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