李海波，魏海龍，胡傳久，付立忠，吳學(xué)謙，吳慶其

（1.浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，杭州 310023；2.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，杭州310013）

大型真菌對(duì)重金屬生物富集現(xiàn)象的認(rèn)識(shí)始于20世紀(jì)70年代蘑菇屬（Agaricus）真菌內(nèi)鎘（Cd）的高水平積累的發(fā)現(xiàn)，隨后人們紛紛發(fā)現(xiàn)很多大型真菌都具有較強(qiáng)富集重金屬如汞（Hg）、Cd、鉛（Pb）、砷（As）、銅（Cu）等的能力和作用。與綠色植物相比，食用菌能夠積累更高濃度的鉛Pb、Cd和Hg等有害重金屬［1－4］。重金屬在食用菌的不同生長(zhǎng)發(fā)育期是必需元素，當(dāng)處于痕量水平時(shí)可促進(jìn)食用菌的生長(zhǎng)，并維持所需重金屬在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)平衡；但是當(dāng)重金屬含量超過一定濃度時(shí)，則對(duì)食用菌形成脅迫毒害作用。香菇是著名的食（藥）用大型真菌，其產(chǎn)量位居所有食用菌類的前三位，在我國(guó)食用菌出口貿(mào)易中占有重要地位。近年來有大量有關(guān)香菇等食用菌重金屬含量的分析檢測(cè)、背景值測(cè)算和富集規(guī)律的研究報(bào)道。這些研究均表明，香菇對(duì)于重金屬元素Pb、Cd、Hg和As具有極強(qiáng)的富集能力，重金屬可積累在香菇的子實(shí)體部分，并通過食物鏈進(jìn)入人體，危害人體健康［5－12］。在自然界中，微量元素并不是單獨(dú)存在的，而且在微量元素之間存在著相互制約的現(xiàn)象，影響著生物對(duì)它們的吸收利用。對(duì)重金屬蓄積植物的研究表明，礦質(zhì)元素鈣（Ca）可以與重金屬Cd競(jìng)爭(zhēng)植物根系上吸收位點(diǎn)，從而降低植物對(duì)Cd的吸收［13］。添加外源Ca可以增強(qiáng)植物對(duì)許多非生物逆境的適應(yīng)性，減輕逆境對(duì)植物所造成的傷害［14］，其機(jī)理可能是通過對(duì)有害礦質(zhì)元素的拮抗作用［15］、維持較高的抗氧化保護(hù)酶系統(tǒng)活力［16］以及發(fā)揮鈣信使系統(tǒng)的功能［17］等。因此，借鑒Ca對(duì)植物抗逆境的保護(hù)作用，通過外源Ca的添加來緩解重金屬對(duì)香菇等栽培食用菌的脅迫毒害作用、抑制其對(duì)重金屬的超量富集是值得探索的一條思路，但迄今為止，在食用菌研究領(lǐng)域，無論在基礎(chǔ)研究層面上，還是應(yīng)用技術(shù)層面上，尚缺乏礦質(zhì)元素（如Ca、Mg、Zn）對(duì)重金屬富集影響的研究，缺乏利用外源礦質(zhì)元素對(duì)重金屬富集的阻斷技術(shù)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 香菇菌種

香菇（Lentinual edodes）菌種939，由麗水市食用菌研究開發(fā)中心提供。

1.1.2 配方

（1）母種培養(yǎng)基配方：2% 葡萄糖、0.2% 酵母粉、0.1%KH2PO4、0.05%MgSO4·7H2O、瓊脂若干。

（2）含重金屬液體培養(yǎng)基配方：在含3% 豆餅粉、2% 葡萄糖、1% 酵母粉、0.5% 蛋白胨、1% 維生素B1、0.1%KH2PO4和0.05%MgSO4·7H2O的液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，分別添加Pb 150mg／L、Cd 20mg／L、As 5mg／L、Hg 20mg／L形成4種含重金屬培養(yǎng)基。每種重金屬培養(yǎng)基中分別添加濃度為0.1、0.5、1.5、3.0g／L的Ca2＋形成4個(gè)處理，不添加Ca2＋作為對(duì)照。

（3）含重金屬栽培基質(zhì)配方：在含78%木屑、20%麩皮，水適量的栽培基質(zhì)基礎(chǔ)上，分別添加如表1所示的重金屬量。再在每種含重金屬的栽培基質(zhì)中分別添加1%、2%、4%、6%的含Ca2＋礦質(zhì)添加劑形成4個(gè)處理，不添加Ca2＋礦質(zhì)添加劑作為對(duì)照。栽培基質(zhì)裝袋制成15cm×55cm的香菇菌棒。

表1 不同重金屬的添加量及菌棒實(shí)測(cè)值 mg·kg－1

1.1.3 試劑

4種重金屬 Pb［Pb（CH3COO）2·3H2O］、Cd（CdCl2·2.5H2O）、As（As2O3）、Hg（HgCl2）和礦物質(zhì)Ca（CaCl2）均購(gòu)自浙江華東醫(yī)藥器化公司。添加在香菇培養(yǎng)基中的重金屬離子和礦物質(zhì)離子均按照分子量換算成相應(yīng)的離子含量，按照添加量的濃度配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中Pb、Cd、Hg是溶于水中配制而成，As是溶于20%的氫氧化鈉溶液中配制而成，礦物質(zhì)Ca是溶于水中配制而成。

1.2 方法

1.2.1 液體培養(yǎng)方法：試驗(yàn)前將香菇菌種轉(zhuǎn)接至PDA斜面活化，24℃培養(yǎng)5天。在500mL三角瓶中裝200mL母種培養(yǎng)基，于121℃滅菌30min。從活化好的斜面菌種上取5塊0.3cm×0.3cm大小菌種塊接種三角瓶中，置搖床上培養(yǎng)（26℃，轉(zhuǎn)速200 r／min）3天。之后取10%轉(zhuǎn)接入含重金屬的液體培養(yǎng)基，置搖床上培養(yǎng)（26℃，轉(zhuǎn)速200r／min）25天后，紗布過濾，菌絲體蒸餾水沖洗后，3000r／min離心15min，棄上清液后，稱重。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10個(gè)搖瓶。

1.2.2 固體基質(zhì)培養(yǎng)方法：在香栽培基質(zhì)添加如表1所示的重金屬和含Ca2＋礦質(zhì)添加劑，裝袋制成香菇菌棒，滅菌后接種香菇膠囊菌種，接種后的培養(yǎng)溫度為25～26℃，按常規(guī)進(jìn)行菌棒培養(yǎng)管理，采用高棚層架栽培模式進(jìn)行出菇管理。出菇后收獲子實(shí)體檢測(cè)重金屬含量。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)25個(gè)菌棒。

1.2.3 重金屬含量檢測(cè)方法：Hg總量測(cè)定（GB／T5009.17－2003）：冷原子吸收光譜法即五氧化二釩消化法檢測(cè)；As總量測(cè)定（GB／T5009.11－2003）：氫化物原子熒光光度法檢測(cè)；Pb總量測(cè)定（GB／T5009.12－2003）：石墨爐原子分光光度法進(jìn)行檢測(cè)；Cd總量測(cè)定（GB／T5009.15－2003）：石墨爐原子分光光度法進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 11.0軟件，對(duì)所有數(shù)據(jù)均以平均均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，各處理間的比較采用最小顯著差值法LSD－t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ca2＋對(duì)培養(yǎng)基污染Pb、Cd、As、Hg的香菇菌絲體生物量的影響

Ca2＋對(duì)培養(yǎng)基污染Pb、Cd、As、Hg的香菇939菌絲體生物量產(chǎn)生了較大影響（表2）。在含有Pb、Cd、As、Hg的液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的香菇939，在未添加Ca2＋時(shí)，其菌絲體生物量分別為0.014、0.245、0.410和0.0820g／100mL，添加 Ca2＋后，其菌絲體生物量呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，當(dāng)Ca2＋添加量達(dá)到3g／L時(shí)，培養(yǎng)基中含有Pb、Cd、Hg的香菇939的菌絲體生物量達(dá)到最大值，分別為0.709、0.85和2.332g／100mL，分別是未添加Ca2＋的50.6、3.5和5.7倍。在含As的培養(yǎng)基中，Ca2＋的添加量為0.1g／L時(shí)，香菇939的菌絲體生物量就達(dá)到了最大值0.44g／100mL，是未添加Ca2＋的5.4倍，繼續(xù)增加Ca2＋的含量，菌絲體生物量呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。這表明在4種重金屬的脅迫作用下，香菇的生長(zhǎng)均不同程度地受到抑制，而外源添加的Ca2＋可能通過離子拮抗作用降低了香菇子實(shí)體對(duì)4種重金屬離子的大量吸收，進(jìn)而減輕重金屬對(duì)香菇的毒害作用。同時(shí)，在Ca2＋的拮抗效果上，Ca2＋對(duì)As富集的拮抗在低添加量（0.1g／L）時(shí)已達(dá)到最大，而對(duì)Pb、Cd、Hg富集的拮抗在高添加量（3.0g／L）時(shí)尚未達(dá)到最大。

表2 Ca2＋對(duì)培養(yǎng)基污染重金屬的香菇939菌絲體生物量的影響 g·100mL－1

2.2 含Ca2＋礦質(zhì)添加劑對(duì)香菇富集重金屬Pb、Cd、As、Hg的影響

由表1可見，即使在香菇固體栽培基質(zhì)中不添加任何濃度的重金屬元素，但在菌棒中依然可以檢出4種重金屬Pb、Cd、As、Hg的存在，這表明香菇培養(yǎng)料（包括木屑、麩皮等）和產(chǎn)地環(huán)境中的土壤、水均含有一定濃度的重金屬元素。在人為添加一定濃度的重金屬元素后，菌棒中的4種重金屬含量顯示出了較大程度的增加，Pb、Cd、As、Hg分別由1.10、0.07、0.19、0.02增至35.06、1.20、6.45、0.89mg／kg干料重。這表明在香菇栽培過程中，外源污染的重金屬元素在栽培菌棒中得到富集，在菌棒中高含量的重金屬元素通過菌絲進(jìn)一步向子實(shí)體遷移，進(jìn)而導(dǎo)致子實(shí)體大量富集重金屬。

我們近年來的研究結(jié)果已表明，香菇栽培基質(zhì)中的重金屬可以通過菌絲體的吸收、富集并進(jìn)一步遷移到香菇子實(shí)體中，栽培者可以從源頭上通過控制培養(yǎng)料中的重金屬限量或阻斷遷移途徑來控制香菇子實(shí)體中重金屬含量［18］。在本研究中，我們嘗試通過使用含Ca2＋礦質(zhì)添加劑來阻斷香菇子實(shí)體對(duì)4種重金屬的富集。由圖1可見，在不添加含Ca2＋礦質(zhì)添加劑時(shí)，香菇子實(shí)體中4種重金屬Pb、Cd、As、Hg的含量分別為1.20、2.70、1.53、1.39mg／kg，隨著含Ca2＋礦質(zhì)添加劑在香菇培養(yǎng)料中添加濃度從1%、2%、4%到6%的逐步提高，4種重金屬的含量呈不斷下降趨勢(shì)，在最高添加濃度為6%時(shí)，Pb、Cd、As、Hg的含量分別下降到了0.45、1.43、0.69和0.28mg／kg，分別降低了62.5%、47.0%、54.9%、79.9%。這表明Ca2＋可能通過離子拮抗作用降低了香菇子實(shí)體對(duì)4種重金屬離子的大量吸收。對(duì)南美蟛蜞菊（Wedelia trilobata）毛狀根毒害的生理機(jī)理研究表明10～30mM Ca2＋可顯著減少毛狀根對(duì)Cd2＋的吸收和吸附，并可調(diào)節(jié)其抗氧化酶活性，降低其膜脂過氧化水平而解除重金屬Cd對(duì)毛狀根生長(zhǎng)的抑制或毒害［19］。此外，對(duì)金針菇、平菇的富集重金屬研究表明，Cd與鋅（Zn）之間存在互相拮抗作用［19］，Ca2＋、鎂（Mg2＋）、鐵（Fe2＋）對(duì) Hg2＋抑制平菇菌絲生長(zhǎng)的毒害有一定的拮抗解毒效果［20］。

圖1 不同濃度含Ca2＋礦質(zhì)添加劑對(duì)香菇富集重金屬的影響

2.3 含Ca2＋礦質(zhì)添加劑對(duì)香菇富集重金屬影響的差異顯著性

表3 含Ca2＋礦質(zhì)添加劑對(duì)香菇富集重金屬影響的差異顯著性

由表3的LSD－t檢驗(yàn)可見，含Ca2＋礦質(zhì)添加劑對(duì)Pb、Hg、As 3種重金屬富集的抑制作用在不同的濃度水平上均存在極顯著差異；在對(duì)Cd富集的抑制作用上，4%和6%的含Ca2＋礦質(zhì)用量與CK、1%、2%用量差異顯著。這表明在香菇培養(yǎng)料中添加含Ca2＋礦質(zhì)添加劑對(duì)Pb、Hg、Cd、As 4種重金屬富集均有抑制作用，香菇子實(shí)體中Pb、Hg、Cd、As含量均會(huì)隨著Ca2＋礦質(zhì)添加量的增加而降低，但Cd只有在Ca2＋礦質(zhì)添加量達(dá)4%和6%時(shí)，才明顯降低。這一結(jié)果提示在香菇栽培生產(chǎn)中，可以通過在栽培基質(zhì)配方中添加含Ca2＋礦質(zhì)添加劑對(duì)Pb、Hg、Cd、As 4種重金屬的富集進(jìn)行阻斷，但針對(duì)不同的重金屬的阻斷效果，添加含Ca2＋礦質(zhì)的用量有所不同。

3 結(jié)論

3.1 香菇液體培養(yǎng)基中添加一定濃度的Ca2＋可以顯著減輕4種重金屬Pb、Cd、As、Hg對(duì)香菇生長(zhǎng)的脅迫毒害作用，增加重金屬脅迫下香菇菌絲體的生物量；

3.2 香菇栽培基質(zhì)中添加一定量的含Ca2＋礦質(zhì)添加劑可顯著抑制子實(shí)體對(duì)4種重金屬離子的大量富集；

3.3 本研究結(jié)果提示在香菇栽培生產(chǎn)中，可以通過在栽培基質(zhì)配方中添加一定量的含Ca2＋礦質(zhì)添加劑對(duì)4種重金屬進(jìn)行阻斷。

［1］ Schmitt J A，Meisch H U，Reinle W.Heavy metals in higher fungi，II，manganese and iron［J］.Zeitschrift fur Naturforschung C，1977，32（9／10）：712－723.

［2］ Varo P，Lahelma O，Nuurtamo M，Saari E，Koivistoinen P.Mineral element composition of finish foods，vii.potato，vegetables，fruits，berries，nuts and mushrooms［J］.Acta Veterinaria Scandinavica，1980，22：89－113.

［3］ Vetter J.Mineral element content of edible and poisonous macrofungi［J］.Acta ali zagon civilne dru?be，1990，19：27－40.

［4］ Mallikarjuna S E，Ranjini A，Haware D J，Vijayalakshmi M R，Shashirekha M N，Rajarathnam S.Mineral composition of four edible mushrooms［J／OL］.Journal of Chemistry，2013.http：／／dx.doi.org／10.1155／2013／805284.

［5］ 雷敬敷，楊德芬.食用菌的重金屬含量及食用菌對(duì)重金屬富集作用的研究［J］.中國(guó)食用菌，1990，9（6）：14－17.

［6］ 邢增濤，王晨光.食（藥）用菌中重金屬的研究進(jìn)展［J］.食用菌學(xué)報(bào)，2000，7（2）：58－64.

［7］ 寇冬梅，陳玉成，張進(jìn)忠.食用菌富集重金屬特征及污染評(píng)價(jià)［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（5）：229－232.

［8］ 徐麗紅，吳應(yīng)淼，陳俏彪，等.香菇對(duì)栽培基質(zhì)中有害重金屬的吸收富集規(guī)律及臨界含量值［J］.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007，19（3）：211－215.

［9］ 柴振林，吳學(xué)謙，魏海龍，等.浙江省鮮香菇背景值及質(zhì)量安全評(píng)價(jià)［J］.中國(guó)食用菌，2008，27（4）：31－33.

［10］ 袁瑞奇，孟祥芬.平菇對(duì)重金屬富集機(jī)理的研究［J］.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，40（2）：181－185.

［11］ 黃晨陽，張金霞.食用菌重金屬富集研究進(jìn)展［J］.中國(guó)食用菌，2004，23（4）：7－9.

［12］ 袁瑞奇，李自剛.食用菌栽培中重金屬污染與控制技術(shù)研究進(jìn)展［J］.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，35（2）：159－162.

［13］ Andersson A，Nillsson K O.Influence of lime and soil pH on Cd availability to plants ［J］.Ambio，1974，3（5）：198－200.

［14］ 姜義寶，李建華，方麗云，等.鈣處理對(duì)苜蓿幼苗抗旱性的影響［J］.中國(guó)草地學(xué)報(bào)，2008，30（1）：117－120.

［15］ Skórzyńska－Polit E，Tukendorf A，Selstam E，Baszynski T.Calcium modifies Cd effect on runner bean plants［J］.Environmental and Experimental Botany，1998，40（3）：275－286.

［16］ 汪洪，周衛(wèi)，林葆.鈣對(duì)鎘脅迫下玉米生長(zhǎng)及生理特性的影響［J］.植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)，2001，7（1）：78－87.

［17］ 汪良駒，劉友良，馬凱.鈣在無花果細(xì)胞鹽誘導(dǎo)脯氨酸積累中的作用［J］.植物生理學(xué)報(bào)，1999，25（1）：38－42.

［18］ 魏海龍，吳學(xué)謙，曹群，等.重金屬元素在香菇栽培基質(zhì)和子實(shí)體中遷移特性研究［J］.中國(guó)食用菌，2009，28（3）：43－16，52.

［19］ 施和平，王云靈，曾寶強(qiáng)，等.外源鈣對(duì)鎘脅迫下南美蟛蜞菊毛狀根生長(zhǎng)、抗氧化酶活性和鎘吸收的緩解效應(yīng)［J］.生物工程學(xué)報(bào)，2012，8（6）：747－762.

［20］ 焦帥，阮榕生，劉玉環(huán)，等.Pb2＋、Hg2＋對(duì)平菇菌絲生長(zhǎng)的影響及中微量元素對(duì)Hg2＋的拮抗解毒效應(yīng)［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（1）：72－75，8.