劉 穎，張 萱，劉純巖，倪文杰，毛洪濤，王珍琦

（1.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 衛(wèi)生部放射生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130021；2.吉林省婦幼保健院中心實(shí)驗(yàn)室，

吉林 長(zhǎng)春 130061；3.吉林大學(xué)第二醫(yī)院科教科，吉林 長(zhǎng)春130041；4.吉林大學(xué)第二醫(yī)院放射線(xiàn)科，吉林 長(zhǎng)春 130041）

神疾病嚴(yán)重影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能，降低生活質(zhì)量。僅美國(guó)就有近四分之一的成年人被診斷為患有精神疾病，如抑郁癥、焦慮癥和精神分裂癥。理解這些精神疾病的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)、減輕癥狀和制定有效的治療手段是當(dāng)今精神病學(xué)發(fā)展的方向。抑郁癥是最普遍的精神疾病，在世界范圍內(nèi)發(fā)病率很高。盡管進(jìn)行了大量的研究工作，但抑郁癥潛在的病理生理機(jī)制仍未完全清楚。海馬是腦內(nèi)在記憶、認(rèn)知和情緒調(diào)節(jié)方面起非常重要作用的區(qū)域。抑郁癥伴有海馬容積的減少及海馬功能缺欠，這很可能與抑郁癥的發(fā)病密切聯(lián)系。此外，研究者[1－3]也進(jìn)行了許多抑郁對(duì)海馬容積影響的研究，發(fā)現(xiàn)早期抑郁已經(jīng)伴有海馬容積的改變，抑郁癥患者海馬灰質(zhì)的減少，可以通過(guò)抗抑郁藥的治療而得到改善[3]。有研究表明：一些抗抑郁藥的確能增加抑郁癥患者的齒狀回細(xì)胞增殖，提示其可能具有神經(jīng)保護(hù)作用，但機(jī)制尚未清楚。本研究采用體外原代培養(yǎng)的SD大鼠海馬神經(jīng)元，復(fù)制谷氨酸（glutamate，Glu）損傷模型，模擬抑郁癥時(shí)大鼠海馬的病理改變，體外研究抗抑郁藥奧氮平對(duì)大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響，從凋亡和細(xì)胞周期的角度，進(jìn)一步探討奧氮平的作用機(jī)制。目前，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)此方面的報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器 在吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買(mǎi)即將分娩的懷孕Wistar大鼠10只，體質(zhì)量約300g，取出生1d的胎鼠用于實(shí)驗(yàn)；高糖和低糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，馬血清為Hyclone公司產(chǎn)品，胎牛血清為北京圣馬生物制品研究所產(chǎn)品，多聚賴(lài)氨酸、胰酶、碘化丙啶（PI）和Hochest33258（Ho）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Glu為上?；ぴ噭┭芯克a(chǎn)品，奧氮平由加拿大薩斯喀切恩大學(xué)李新民教授惠贈(zèng)，其余試劑為市售分析純；流式細(xì)胞儀為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品。

1.2 原代神經(jīng)元培養(yǎng) 取出生1d的 Wistar大鼠，經(jīng)75%的酒精消毒，無(wú)菌條件下開(kāi)顱取海馬；置于冷的無(wú)Ca2＋、Mg2＋的D-Hank’s液中，剪碎成0.5mm×0.5mm×0.5mm 的小塊；置于 DHank’s管中靜止5min后，棄去上清，加入0.25%胰蛋白酶2mL，于37℃消化15～20min，加入5mL培養(yǎng)液（高糖DMEM、10%胎牛血清、10%馬血清）終止消化；Paster滴管吹打，離心（1 500r·min－1、5min）2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106mL－1。將細(xì)胞懸液加入事先用聚L-lysine處理過(guò)的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中。置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。第2天全部換液，以后每3d換半液。

1.3 Glu損傷模型的復(fù)制 參照文獻(xiàn)[4]，稍加改進(jìn)。神經(jīng)元培養(yǎng)至2周時(shí)，細(xì)胞成熟可用于實(shí)驗(yàn)。在應(yīng)用Glu前6～12h，將海馬神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)液換成無(wú)血清的培養(yǎng)液，去除外源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。實(shí)驗(yàn)時(shí)吸去培養(yǎng)液，以Tris緩沖液（25mmol·L－1Tris-HCl、120mmol·L－1NaCl、1.8mmol·L－1CaCl2、5.4mmol·L－1KCl和 15mmol·L－1Glucose，調(diào)pH值為7.4）洗2次，加入終濃度為500μmol·L－1Glu，將奧氮平加入低糖、無(wú)血清培養(yǎng)基中，而后加入培養(yǎng)板中，空白培養(yǎng)液補(bǔ)足體積。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。模型復(fù)制完成后，采用MTT法檢測(cè)神經(jīng)元存活率以判定模型復(fù)制是否成功。

1.4 細(xì)胞分組及處理 培養(yǎng)2周的海馬神經(jīng)元隨機(jī)分為正常對(duì)照組（吸除原有培養(yǎng)基，單純更換低糖DMEM培養(yǎng)基）、Glu損傷組（吸除原有培養(yǎng)基，換成終濃度為500μmol·L－1Glu的低糖DMEM培養(yǎng)基）、奧氮平 ＋Glu損傷組 [吸除原有培養(yǎng)基，分別加入不同濃度（0.1、1.0、10.0、50.0、100.0、200.0和500.0μmol·L－1）奧氮平，且Glu終濃度為500μmol·L－1的無(wú)血清、低糖DMEM培養(yǎng)基]。在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h，而后分別測(cè)定各組神經(jīng)元凋亡率、壞死率和細(xì)胞周期的改變。

1.5 檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期的變化 收集細(xì)胞，用8mL PBS離心1 500r·min－1×5min×3次，加入1mL PBS重懸細(xì)胞，用4mL冷乙醇固定，置－20℃冰箱過(guò)夜，離心（1300r·min－1、5min），洗 去 固 定 液，加 入 PBS 離 心（1 300r·min－1、5min），棄上清。而后，每份樣品加入RNaseA 100μL（100mg·L－1），37℃孵 育 30min，加 PI（含 0.1%Triton X-100）300μL（50mg·L－1），4℃避光負(fù)染30min，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，CellQuest軟件收集1×104個(gè)細(xì)胞，采用ModFit LT軟件分析細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期的變化。細(xì)胞凋亡率（%）＝（凋亡細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1.6 Ho和PI雙染檢測(cè)神經(jīng)元壞死率 用0.1%Triton X-100作用1h作為細(xì)胞壞死的陽(yáng)性對(duì)照，每份樣品中加Hochest 33258 150μL（100mg·L－1），PI 100μL（0.05g·L－1），37℃溫育30min后，采用流式細(xì)胞儀收集1×104個(gè)細(xì)胞，CellQuest軟件分析結(jié)果，計(jì)算細(xì)胞壞死率。細(xì)胞壞死率（%）＝（壞死細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。神經(jīng)元凋亡率和壞死率以（±s）%表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組神經(jīng)元凋亡率 與正常對(duì)照組比較，Glu損傷組和奧氮平＋Glu損傷組細(xì)胞凋亡率增加（P＜0.05或P＜0.01）；與 Glu損傷組比較，10.0μmol·L－1奧氮平＋Glu損傷組細(xì)胞凋亡率下降（P＜0.01）。見(jiàn)表1和圖1（插頁(yè)一）。

2.2 各組神經(jīng)元壞死率 與正常對(duì)照組比較，Glu損傷組神經(jīng)元壞死率升高2.9倍（P＜0.05）；與Glu損傷組比較，奧氮平＋Glu損傷組細(xì)胞壞死比率降低。100.0和200.0μmol·L－1奧氮平＋Glu損傷組壞死降低最為顯著（P＜0.05或P＜0.01）。見(jiàn)表1。

2.3 各組神經(jīng)元細(xì)胞周期 與正常對(duì)照組比較，Glu損傷組神經(jīng)細(xì)胞周期各時(shí)相細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)發(fā)生變化，G0/G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)增加（P＜0.01），S期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)下降（P＜0.01），G2＋M期變化不明顯。而與 Glu損傷組比較，50.0、100.0和200.0μmol·L－1奧氮平＋Glu損傷組神經(jīng)細(xì)胞周期進(jìn)程發(fā)生顯著變化，G0/G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)下降，S期和 G2＋M 期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)上升。50.0和100.0μmol·L－1奧氮平＋Glu損傷組G0/G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別下降為Glu損傷組的79.9%和62.6%（P＜0.05或P＜0.01），S期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為Glu損傷組的2.5和3.8倍（P＜0.05或P＜0.01）。見(jiàn)表2。

表1 各組神經(jīng)元凋亡率和壞死率Tab.1 Apoptotic rates and death rates of neurons in various groups [η/（±s）%]

表1 各組神經(jīng)元凋亡率和壞死率Tab.1 Apoptotic rates and death rates of neurons in various groups [η/（±s）%]

＊ P＜0.05，＊＊ P＜0.01 vs normal control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs Glu injury group；“—”：Not detected.

Group Apoptotic rate Death rate 1.4±0.4 15.3±0.6 Glu injury 4.3±0.5＊＊ 44.0±4.6＊0.1μmol·L－1 olanzapina＋Glu injury — 38.4±8.3 1.0μmol·L－1 olanzapina＋Glu injury — 29.7±2.2 10.0μmol·L－1 olanzapina＋Glu injury 1.8±0.3＊△△ 25.2±4.9 50.0μmol·L－1 olanzapina＋Glu injury 2.2±1.4＊ 25.1±3.2 100.0μmol·L－1 olanzapina＋Glu injury 3.5±2.4＊ 24.4±5.0△△200.0μmol·L－1 olanzapina＋Glu injury 2.1±0.9＊ 24.1±11.0△500.0μmol·L－1 olanzapina＋Glu injury —Normal control 38.9±0.6

3 討 論

本文作者近年在抗抑郁藥的神經(jīng)保護(hù)作用方面進(jìn)行大量研究[5－10]發(fā)現(xiàn)：抗抑郁藥萬(wàn)拉法新和奧氮平在體外實(shí)驗(yàn)中均都能抵抗Glu誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷，維護(hù)細(xì)胞膜的完整性，減少乳酸脫氫酶的漏出，增加超氧化物酶活性，提高神經(jīng)元存活率，使存活細(xì)胞數(shù)量增加，證實(shí)二者可能均具有神經(jīng)保護(hù)作用[5－7]。但其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步闡明。因此，本文作者又采用體外原代培養(yǎng)的Wistar大鼠海馬神經(jīng)元，復(fù)制Glu損傷模型，模擬抑郁癥時(shí)的病理改變，在體外研究抗抑郁藥萬(wàn)拉法新和奧氮平對(duì)大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響。

表2 各組神經(jīng)元細(xì)胞周期Tab.2 Cell cycles in various groups [η/（±s）%]

表2 各組神經(jīng)元細(xì)胞周期Tab.2 Cell cycles in various groups [η/（±s）%]

＊ P＜0.05，and＊＊ P＜0.01 vs Glu injury group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs normal control group.

Group G0/G1 S G2＋M 72.5±0.2 25.3±0.6 2.1±0.9 Glu injury 88.2±0.5△△ 11.5±0.5△△ 0.3±0.0 10.0μmol·L－1 Olanzapine＋ Glu injury 91.1±4.1 7.9±5.2 1.0±1.1 50.0μmol·L－1 Olanzapine＋ Glu injury 70.5±3.9＊ 28.8±4.3＊ 0.7±0.6 100.0μmol·L－1 Olanzapine＋ Glu injury 55.2±0.5＊＊△ 43.8±1.6＊＊△ 1.0±1.2 200.0μmol·L－1 Olanzapine＋ Glu injury Normal control 82.1±11.9 17.5±12.2 0.4±0.3

本研究結(jié)果顯示：高濃度Glu影響體外培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的存活，使凋亡和壞死均明顯增加，且以壞死為主；而奧氮平能明顯抵抗Glu誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷，使凋亡率和壞死率均明顯下降，且最佳濃度為10～200μmol·L－1。結(jié)合以往研究[10－11]結(jié)果發(fā)現(xiàn)：萬(wàn)拉法新和奧氮平具有共同的作用趨勢(shì)，均能減少Glu損傷引起的凋亡和壞死，二者比較，奧氮平的作用強(qiáng)于萬(wàn)拉法新。提示抵抗Glu損傷可能是二者共同的機(jī)制。在本研究中，與Glu損傷組比較，10.0～200.0μmol·L－1奧氮平＋Glu損傷組細(xì)胞凋亡率和壞死率均呈下降趨勢(shì)，而在低于10.0μmol·L－1和高于200.0μmol·L－1奧氮平的濃度下，結(jié)果無(wú)明顯變化，原因考慮是當(dāng)奧氮平濃度低于10.0μmol·L－1時(shí)，藥物未達(dá)到有效劑量，所以對(duì)于Glu引起的損傷未產(chǎn)生抵抗作用；而濃度高于200.0μmol·L－1時(shí)，由于奧氮平濃度過(guò)高，本身可能就會(huì)有一定的毒性作用，造成凋亡和壞死細(xì)胞比例無(wú)明顯變化。本研究結(jié)果顯示：Glu誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷使G0/G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)增加，S期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)下降，表明Glu抑制神經(jīng)元的DNA合成，減少了細(xì)胞的增殖；而奧氮平作用后，表現(xiàn)為G0/G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)不同程度減少，S期細(xì)胞增加，進(jìn)入DNA合成期的細(xì)胞增加，促進(jìn)細(xì)胞增殖。在以往的研究[9]中，萬(wàn)拉法新也表現(xiàn)出了同樣的作用趨勢(shì)，表明抗抑郁藥促進(jìn)神經(jīng)生成的作用很可能是通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞增殖實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，抗抑郁藥奧氮平和萬(wàn)拉法新均具有神經(jīng)保護(hù)作用，且均能促進(jìn)S期細(xì)胞增加，抵抗Glu引起的細(xì)胞凋亡和壞死，這很可能涉及二者共同的作用機(jī)制，下一步研究應(yīng)當(dāng)從影響凋亡和細(xì)胞周期的基因表達(dá)入手，從分子水平進(jìn)一步揭示其機(jī)制，為指導(dǎo)臨床合理用藥提供確鑿的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

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